瑞沃德-沃的实验-PCR技术答疑

1. PCR实验重复性很差是什么原因呢？

答：这个看是哪类重复性很差。

如果是同个批次内的复孔重复差，第一个主要原因：以加样操作不准确导致，可以使用排枪或规范移液枪使用来减少操作误差，还有需要定期对移液枪进行校准哦；第二个原因：仪器使用年限过长，PCR仪器的每个孔的温度存在差异，这个需要检修校准；第三个原因：模板浓度太低，样品初始浓度越低,，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。

如果是不同批次间的重复差，除却以上原因，还存在试剂上的批次差异，应当减少试剂批次和种类的差异，尽量选择同一生产商同一批次的产品进行。

2.请问我的标准曲线扩增不出来是怎么回事？

答：这个只能例举一些情况，需要进行排查。首先可以使用一个明确知道是正常PCR体系（阳性对照）进行测试，这样排查下是否是PCR试剂仪器等因素，第二，由于是标准曲线，标准样DNA模板，用NanoDrop或者Qubit核酸蛋白定量仪检查模板质量和浓度。

3.出现片状拖带该怎么解决呢？

答：首先出现片状带往往是因为PCR体系中DNA酶过量、镁离子浓度过高或者退火温度低，循环次数等原因造成，需要挨个排查，退火温度可以通过设置退火温度梯度去摸索其条件，往往需要提高退火温度，PCR体系的问题可以适当减少PCR体系中酶、镁离子的用量。循环次数可以适当减少也可以避免一些情况。这些条件都需要摸索。此外，也可能是DNA电泳的琼脂糖凝胶问题，需仔细排查。

4.如何判断假阴性或假阳性？

答：PCR实验中，假阳性的发生率比假阴性的发生率要低，这是因为往往PCR引物设计时候是特异性高的引物，往往可以根据扩增条带在DNA电泳下的条带大小进行产物长度的判定来验证，此外，排除假阳性的结果往往都是扩增产物进行测序验证可以进一步论证其结果可靠性。

假阴性的结果就比较复杂了，一般会设计一个阳性对照实验，来排除PCR体系中试剂本身失效或者PCR仪器带来影响，然后还需要检查实验过程所使用DNA模板的情况，一般NanoDrop或者Qubit核酸蛋白定量仪检查模板质量和浓度。

5.如何确定设置的PCR的体系是正确的呢?

答：设置阳性对照往往是一个不错的选择，可以检查PCR体系中试剂（比如酶的活性）是否能正常使用。此外引物与模板情况，如果严谨，可以检查引物与模板的质量和浓度，再者就是一个合适的退火温度，可以设置温度梯度进行PCR，然后DNA电泳后观察条带情况来进行选择合适的退火温度。最后就是确定扩增产物的正确性，是DNA电泳判读扩增条带长度是否准确，其次是胶回收进行扩增产物的测序验证。

6.如何确定引物的浓度？

答：这个需要根据情况，引物合成公司会首先提供每个引物的原始储存浓度，然后根据其浓度加入双蒸去离子水稀释，稀释成PCR体系使用的浓度，然后就是换算问题，一般引物合成公司会给一个度量指标是OD，一般来说会附带一个说明书，一般1OD是5nmol，也就是说加入500uL水后就是10umol/L，根据PCR体系推荐的引物摩尔数，计算1uL引物加入也就是10pmol的量，这块往往这个根据PCR试剂盒会有推荐引物浓度（根据PCR体系不同进行调整）。

7.PCR扩出来的条带亮度很弱，如何排查原因呢？

答：一般扩出来条带是正确大小长度下还是很弱的亮度的话，往往是扩增效率不高，这个可以首先加入阳性对照，确保仪器和PCR试剂盒如酶是正常的。第二要考虑DNA模板的问题，先检查模板质量和浓度，浓度过低条带暗，浓度过高，PCR反应会受到抑制，扩增效率不高，还有DNA纯度不高也会影响扩增效率。第三，退火温度，这块可以设置一个退火温度梯度进行试验，确定最佳退火温度，最后，就是引物的问题，引物设计不太好，存在引物自身或引物间的互补配对情况。

8.如何设计引物，注意事项有哪些呢？

答：引物设计的原则非常多，需要考虑的因素很多，但是其最大的原则是特异性！

特异性：必须要保证引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

长度：一般引物长度在15-30bp，有时候可能因特殊原因50bp也可。

GC含量：一般40%-60%。

碱基随机分布：引物碱基序列分布尽量随机，不要连续很多个相同碱基。

引物的二级结果应当避免：引物自身、或者两个引物间，尽量不要有互补结构。

引物的3′端必须高度保守：引物3′端务必与模版完全匹配，特别是最后一个碱基。这样DNA酶才能顺利匹配模板DNA进行复制延伸。

引物的5′端可以进行修饰：可以加入酶切位点，标记荧光、生物素等，也可以设计引入突变位点等情况。

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