光遗传实验操作及注意事项

光遗传学（optogenet-ics）是一种通过使用光学技术和遗传技术来实现控制细胞行为的方法，它克服了传统电刺激和药物手段激活/抑制细胞或组织，空间和时间分辨率低的缺点，为神经科学提供了一种变革性的研究手段。

该技术利用分子生物学、病毒生物学等手段，将外源光敏感蛋白基因导入活细胞中，在细胞膜结构上表达了光敏感通道蛋白；然后通过特定波长光的照射，控制细胞膜结构上的光敏感通道蛋白的激活与关闭；光敏感蛋白的激活和关闭可控制细胞膜上离子通道的打开与关闭，进而改变细胞膜电压的变化，如膜的去极化与超极化。

当膜电压去极化超过一定阈值时就会诱发神经元产生可传导的电信号，即神经元的激活；相反，当膜电压超极化到一定水平时，就会抑制神经元动作电位的产生，即神经元的抑制。神经元生物学家经常运用这种技术，通过光学方法无损伤或低损伤地控制特异神经元的活动，来研究该神经网络功能，特别适用于在体、甚至清醒动物行为学实验。

同时，利用类似的光学与遗传学手段，可控制脑细胞外其它细胞中的蛋白表达，从而实现光诱导蛋白质表达，启动细胞内生物学过程，进而控制生物行为。因此光遗传技术在生命活动与疾病研究中应用广泛。

相关实验包括光通道选择、立体定位手术、注射病毒、埋植光纤、光遗传学实验设计、光遗传行为学、电生理读取。今天给大家探讨一下如何根据实验需求确定病毒注射脑区和光纤埋植以及其他技术问题。

光遗传学

研究步骤

1、细胞特异性标记方法

光遗传学技术通过一定波长的光对细胞进行选择性地兴奋或者抑制，达到控制特定类型细胞活动的目的。光遗传学技术对细胞的选择性目前主要通过三种方法实现：

1） 通过病毒载体直接选择性表达光感基因。相比转基因动物，病毒载体具有很多优势，包括：制备周期短，从载体克隆到病毒表达只需要数周时间就可以完成；可用于难以转基因的动物，如灵长类等；病毒表达只局限于注射位点，如某个特定的脑区，因此具有空间选择性；某些病毒具有天然嗜性，只感染一些特定的细胞类型等。目前广泛用于光遗传学研究的病毒载体是慢病毒和腺相关病毒载体。

病毒注射工具准备

病毒注射

痕量病毒注射常见问题解析：

a病毒保存：病毒-80分装储存，避免反复冻融，4度保存建议不超过一周。使用过程中病毒置于冰上或放在4度冰箱，尽量减少在室温的放置时间。

b病毒稀释：无菌PBS或生理盐水稀释均可，稀释后尽量一次用完。

c病毒注射针尖堵住的处理方法：首先使用生理盐水棉球擦拭针尖，注射泵快推后针尖仍堵住则要剪掉部分电极尖端。

d确定注射到脑组织：观察玻璃电极内病毒与液体石蜡接触液面分层是否下降。

e病毒较多漏到目标脑区上方核团的原因：注射完停针时间不够，原则上不少于10min；注射速度较快，建议注射速度选择10-30nl/min，注射时间控制在10min为宜。

f根据目标核团、病毒滴度、病毒种类和功能元件大小确定注射量。

2） 通过转基因动物直接选择性表达光感基因。转基因动物已经成为一项成熟的技术，转基因动物比局部通过病毒转染而导入光敏感通道的方法具有遗传稳定、效率高等优点。

3） 依赖重组酶(Cre)的腺相关病毒选择性表达光感基因。相比直接转光感基因动物，依赖重组酶的光感基因表达系统具有更好的空间选择性，另外，因为Cre重组酶的特异性表达决定了细胞选择性，因此可以方便地更换各种光感基因腺相关病毒。相比直接表达的病毒载体系统，依赖重组酶的光感基因表达系统的细胞选择性更广泛，结合目前已经培育的很多Cre转基因小鼠品系，能够满足大部分细胞选择性的实验要求。

2、光刺激参数的选择

1） 通常来说光刺激的参数主要包括波长、光强度、频率和占空比。波长取决于光敏感蛋白的种类，如ChR2可以选择473nm激光器，NpHR选择593nm激光器。对于兴奋性光敏感通道蛋白来说光强度的选择很大程度上依赖其自身的特性，不同的光敏感蛋白有不同的光刺激阈值，取决于细胞受光刺激后产生内向电流的大小，电流越大，越容易爆发动作电位，需要的光强相对越低。光强太大容易产生额外的动作电位，延长刺激时间即脉宽也增加了内流入细胞的阳离子量，同样会产生非一对一的光电流，这与光遗传学技术精细调控神经元的优点是相悖的，因此要采取合适的光强和刺激脉宽。最重要的是频率的选择，因为大脑的神经元都有各自合适的放电频率，一般来说锥体神经元放电频率在10Hz左右，而抑制性中间神经元放电频率高达40Hz以上。同时刺激频率还与光敏感蛋白本身的动力学特征有关，野生型的ChR2在40Hz以上光刺激时大部分动作电位都丢失了，甚至呈现一种“抑制”的现象，而作为变体的ChETA，如果表达在PV神经元上，即使光刺激频率高达200Hz，依然能产生一对一的响应。而对于抑制性的NpHR、Arch或Mac来说，连续的光照才能很好的消除细胞的自发电活动。因此，实验前首先考虑的是要刺激的神经元类型，选择合适的光敏感蛋白，再确定光刺激的各种参数。

2） 光照在脑组织传播距离

3） 光强的计量单位是光功率密度（irradiance）mW/mm2。如上图所示，蓝光（473 nm）和黄光（594nm）的功率大概在离尖端0.75mm左右降到1%。注意，光强的大小跟传播距离大小是非线性的！在这里（http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php）有一个计算器可以估计不同波长的光在不同距离的光功率密度，以此为根据，估计光纤深度跟目标脑区之间的距离。比如473nm激活的ChR2，正常表达，大概需要光强1-5mW/mm2，如果光纤末端输出为5mW，那么距离尖端约0.35mm-0.75mm的神经元都可以被激活。

3、光刺激行为学实验及分析

1） 动物handle和习惯化处理。提前两天对经过病毒效果检测并且植好光纤的小鼠进行handle，主要是抚摸小鼠的背部，以减少实验时小鼠的应激反应。每只老鼠约5-7min。第三天，将埋植好光纤的小鼠放置在测试装置中的箱体，让小鼠适应箱体的环境，每只小鼠约10min。注意放置之前和之后，都要用75%的酒精擦洗，以排除外界的干扰。

2） 光刺激装置的连接。将蓝光发生器和任意函数发生器连接，使蓝光发射器发射波长为473nm的蓝光经过波形示波器调制，然后通过设置任意函数发生器，调制给予小鼠刺激的光学参数。

3） 常用的测试方法包括条件行为操作（斯金纳箱）、旷场箱（open field），高架十字迷宫（elevated plus maze），水迷宫（water maze）和Y迷宫（Y maze）等等。

4） 行为学数据分析。将光刺激实时记录的行为，通过线下人工、ABETII软件、SMART3.0行为学分析软件进行分析。