冷冻切片前处理操作以及注意事项有哪些？

目的及原理

临床冷冻切片场景主要应用在术中快速病理诊断，此时术中取下的组织直接进行冷冻切片，后进行快速染色，一般不进行前处理。

科研场景往往对已造模的大、小鼠先进行灌注固定、取材、梯度脱水后保存等待冷冻切片。灌注固定的目的主要是保证离体后的组织细胞与在体时形态相似，保持蛋白质和核酸的基本结构，避免溶酶体的破坏作用导致细胞破裂，同时防腐。

处理流程

1、灌注（以小鼠-脑组织为例）

目的：通过脉管系统将固定液输送到各个器官，实现快速固定。小动物一般通过心脏进行灌注，大动物推荐动脉灌注。

灌注液：生理盐水/PBS、多聚甲醛PFA。

使用设备：瑞沃德TAIJI麻醉机、手术操作台（或泡沫板）、眼科剪、解剖镊、止血钳、一次性输液器、生理盐水注射瓶、多聚甲醛注射瓶等。

灌注流程：

1）使用瑞沃德TAIJI小动物麻醉机将小鼠麻醉，腹部朝上固定在小动物手术操作台上，同时将生理盐水注射瓶、PFA注射瓶挂在输液架或输液吊杆上。

2）在小鼠剑突下缘做皮肤横切口，暴露出剑突后沿着左右两侧剪开暴露膈肌，再沿着头端向上剪开暴露胸腔，可向下做拓展切口完全暴露肝脏，以观察灌注效果。

3）在剑突下将膈肌剪开，此时可暴露左右肺和心尖。再用剪刀沿着两侧向头端方向剪断肋骨。

4）用夹持镊夹住剑突向上翻，暴露出左右肺、心脏、胸腺，同时固定夹持镊在操作台上避免晃动。

5）使用一次性输液针的输液针头穿刺进入左心室（心尖稍左朝上的部位）中，用止血钳连同心肌将置于左心室内的输液针夹持固定，防止输液针脱落，同时固定止血钳至操作台上避免晃动。此时将输液针的塑钢针连通生理盐水注射瓶，旋紧输液针流量调节器。

6）剪破右心耳，循环血液和灌注液会经循环系统通过右心耳开口排出。同时打开流量调节器，使的生理盐水进入血液循环，直至右心耳排出的液体几乎澄清后，旋紧流量调节器。

7）将输液针塑钢头从生理盐水瓶取下插入至PFA瓶，再打开流量调节器进行小鼠全身固定。在固定液灌注过程中，可观察到小鼠尾巴从平躺→直立→平躺的过程，若观察到肝脏无血色，肺部发白，小鼠全身僵硬，则代表灌注成功。

2、取材

目的：取下组织进行脱水、切片。

使用器械：弯解剖镊、解剖剪、眼科剪等。

取材过程：

1）使用解剖剪，将已通过灌注固定的小鼠头颅剪下。

2）使用眼科剪从枕端沿着鼻端剪开小鼠头顶部皮肤，暴露出颅顶的颅骨，此时可见颅骨连接处形成的冠状缝、矢状缝、Bregma和Lambda点。

3）使用眼科剪沿着颅骨矢状缝剪开颅骨，注意刀尖从枕部插入时需顶住颅骨再剪开，避免剪刀损伤大脑皮质；再利用解剖镊或者眼科剪的刀背向矢状缝两侧将颅骨剪开的颅骨撬开。

4）使用弯钩镊轻柔、缓慢的分离脑组织与颅骨的连接处，同时夹断颅底的脑神经，必要时可同时将大脑前端的嗅球去除（根据实验需要），此时注意弯钩镊不要损伤大脑皮质，避免脑膜拉扯导致皮质损伤；分离出脑组织后将脑组织泡在PBS中并放置在冰上。

3、脱水

目的：通过不同浓度的糖溶液将脑组织中的水分置换，避免冷冻切片时冰晶产生。

脱水剂：20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液。

脱水流程：将脑组织浸泡在20%蔗糖溶液，其沉底后将溶液替换为30%蔗糖溶液，待其沉底，置于4℃冰箱内。

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