如何构建皮肤创伤愈合模型？
前言
皮肤创伤愈合作为机体重要的生理修复过程，涉及复杂的细胞迁移、增殖及分子调控网络，其机制研究对临床创面管理具有重要指导意义。小鼠皮肤创伤愈合模型因具有遗传背景清晰、操作可控性强及与人类愈合过程高度保守等特点，已成为揭示皮肤再生机制和评估新型治疗策略的核心工具。
然而，单纯的皮肤创伤愈合模型难以全面模拟临床常见合并代谢性疾病或循环障碍的慢性难愈性创面特征，如糖尿病皮肤溃疡患者普遍存在的糖代谢紊乱、慢性炎症微环境及血管新生障碍等特殊病理状态。
因此，近年来研究者逐步将创伤模型与糖尿病、动脉硬化或免疫缺陷等疾病模型联合构建，通过病理微环境与创伤修复的动态互作模拟复杂临床表型。
1. 材料
1. 实验动物
1）物种：C57BL/6小鼠（8-10周龄）。
2）饲养条件：SPF级环境，12小时光暗循环，自由饮水。
2. 造模材料
皮肤打孔器、皮肤消毒液、剪刀、镊子。
3. 造模方法
1）小鼠麻醉后，使用剃毛器去除背部毛发，用脱毛膏脱去多余毛发，使皮肤完全暴露。脱毛面积需从创面位置向周围扩大2-3倍，防止周围毛发生长影响创面愈合。
2）背部皮肤消毒后，用直径6mm皮肤打孔器在各组小鼠背部正中靠近尾部位置制作创口。因小鼠皮肤较薄，制作真皮层创口难度较大，一般制作全层皮肤切除创口。
tip：
一、 如进行糖尿病小鼠的创面愈合实验，需考虑麻醉剂对小鼠的影响，建议使用气体麻醉方式麻醉，缩短麻醉时间。
二、小鼠创口制作面积6mm为宜，一般14天即可观察到创面大幅度缩小且结痂；8mm创面需20天以上。
2. 模型评估
2.1 创面愈合情况观察
可于拍摄造模前后及愈合过程中的创面照片，Image J 软件统计创面面积，计算创面愈合率。
2.2 创面组织病理学观察
实验终点，取创面及周围正常皮肤组织，进行病理检查。使用HE染色等染色方法观察创面表皮细胞爬行、肉芽组织新生情况。
创面皮肤染色后的病理学观察
参考文献：
【1】 杨丹阳,张暇蔚,姚文涛,等.鸡血藤对db/db糖尿病皮肤溃疡小鼠创面愈合的影响及作用机制研究[J].世界中医药,2024,19(23):3583-3591.
固定：选择适当的固定时间和温度，以确保组织结构的完整性。
脱水与透明：控制好酒精和透明剂的处理时间，避免过度脱水导致的组织损伤。
包埋与切片：除了选择合适的石蜡种类和熔点，还需调整皮肤组织包埋位置，包埋时需将皮肤切面垂直于包埋盒底部，切片时将皮肤外表面先接触刀片，保证切片的连续性和完整性。
染色;染色剂的选择和染色时间的控制对结果影响很大，需要根据实际情况进行优化。
脱蜡与封片：脱蜡要彻底，封片时要确保切片平整、无气泡。
冰冻切片
取材：获取新鲜皮肤组织样本。
包埋及速冻：将皮肤组织放置于样品托上，使用OCT进行包埋，一般组织最大面为包埋面;开启快冷模式，2min后将样品托放置于快冷点上进行速冻，观察到包埋剂三分之二凝固后可使用冷锤从组织上部进行冷却，加快速冻时间。
切片：使用瑞沃德FS800系列冷冻切片机进行皮肤组织切片时样本头温度设置为-18℃℃，箱体温度设置为-25°℃左右;切片时先将皮肤外表面接触刀片。
贴片及染色：切好的组织薄片使用玻片贴片后进行染色。
瑞沃德FS800系列冷冻切片机应用于皮肤组织
切片优点：
“寒武”制冷系统：全开窗切片温度变化不超过2℃，温控更精准，切片操作更便捷;速冻台温度可将至-60℃，30s组织快速冷冻，保障制片效果。展片大师”防卷系统:即装即稳，切片全程无需反复调节，切片展平0失误。
