糖尿病神经病理性疼痛治疗新靶点
文章概述
糖尿病神经病理性疼痛（Diabetic Neuropathic Pain, DNP）是糖尿病患者常见的严重并发症，约25%~30%的糖尿病患者会受出现DNP，其临床表现为机械性痛觉过敏、自发性疼痛和感觉异常（如麻刺感、针刺感或电击感）。目前，DNP的发病机制尚未完全阐明，也缺乏有效的治疗方法。2022年4月6日，浙江大学医学院脑科学与脑医学学院徐贞仲课题组联合浙江大学基础医学院生物物理学系杨帆课题组共同发表题为“GPR177 in A-fiber sensory neurons drives diabetic neuropathic pain via WNT-mediated TRPV1 activation”的研究论文。该研究揭示了初级感觉神经元中G蛋白偶联受体177（G protein–coupled receptor 177, GPR177）通过WNT5a介导的TRPV1离子通道激活来驱动糖尿病性神经痛发生的分子细胞机制，为治疗DNP提供了一个潜在靶点和理论依据。
核心观点
1、GPR177主要表达于DRG中大直径的A纤维感觉神经元中，是小鼠DNP形成所必需的；
2、GPR177介导DRG神经元向脑脊液分泌WNT5a，这是维持DNP所必需的；
3、WNT5a通过激活DRG痛觉神经元和增强脊髓兴奋性突触传递来诱发DNP症状；
4、GPR177/WNT5a在人的DRG神经元中表达，DNP患者脑脊液中WNT5a含量升高。
研究结果分析
1. DNP的形成需要DRG神经元中的GPR177
为了确定GPR177在小鼠DRG神经元中的表达模式，作者采用原位杂交技术检测了Gpr177 mRNA在小鼠DRG中的表达。结果显示，Gpr177 mRNA能够与神经元标记物Nissl很好的共定位，并且Gpr177 mRNA主要表达于中到大直径的DRG神经元中，且主要与NF200共定位（NF200是有髓鞘的A纤维的标志物），提示Gpr177在小鼠DRG中主要表达于有髓鞘的A纤维神经元中。为了评估GPR177在DNP形成中的潜在作用，研究者检测了链脲霉素（Streptozotozin, STZ）诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠模型中Gpr177 mRNA的表达情况，结果表明，Gpr177在糖尿病小鼠DRG中的表达显著上调。
为了进一步研究GPR177在DRG神经元中的作用，研究者用到了Gpr177条件敲除（Gpr177 CKO）的小鼠。该品系小鼠表现出正常的运动功能、疼痛阈值、对轻微触觉的感知、以及对辣椒素或福尔马林所诱导的疼痛反应。提示条件性敲除DRG神经元中Gpr177不会损害基础的运动和感觉功能，以及对伤害性刺激的反应。接下来，研究者测试了敲除Gpr177对STZ诱导DNP的影响。STZ可诱导野生型（Wild Type, WT）小鼠产生强烈的机械性痛觉过敏，但是在Gpr177 CKO小鼠则没有观察到该表现。此外，在位置逃避/回避（Place Escape/Avoidance, PEA）测试中，在Von Frey丝刺激下，STZ诱导的WT小鼠在受刺激侧停留的时间更短，甚至在刺激后也表现出厌恶反应，而STZ诱导的Gpr177 CKO小鼠则没有表现出明显的厌恶行为。这些结果表明，DRG神经元中GPR177在DNP的形成中是必需的，包括机械性痛觉过敏和厌恶行为。考虑到DRG痛觉神经元在DNP中的重要作用，研究者利用膜片钳记录了糖尿病小鼠DRG痛觉神经元的兴奋性。结果显示，在STZ诱导的WT小鼠DRG中，小直径的痛觉神经元具有更低的基强度和更高的放电频率，而在Gpr177 CKO小鼠中，STZ诱导的痛觉神经元的高兴奋性被消除。此外，研究者还评估了STZ诱导的表皮内神经纤维（Intraepidermal Nerve Fiber, IENF）丢失情况，这是糖尿病周围神经病变的金标准。结果显示，STZ诱导的WT小鼠外周神经末梢的IENF密度降低，而STZ诱导的Gpr177 CKO小鼠外周神经末梢的IENF密度未见下降。
这些结果表明，DRG神经元中的GPR177是STZ诱导糖尿病小鼠的神经病理性疼痛、DRG痛觉神经元高反应性以及周围神经病变所必需的。
2. DRG神经元向脑脊液中分泌WNT5a依赖GPR177的调控
考虑到GPR177在果蝇中对WNT蛋白分泌的专门作用，研究者试图阐述GPR177是否在DNP形成过程中同样作为WNT分泌的调节因子。qPCR结果显示，Wnt5a的表达在STZ处理后出现上调，此外，Wnt5a mRNA在中大直径DRG神经元中主要与A纤维神经元的标记物NF200共表达。并且STZ处理后，DRG中WNT5a+神经元增加，主要分布在NF200+的A纤维神经元中。为了验证DRG神经元GPR177通过调节WNT5a的分泌促进DNP形成的假设，作者比较了WT和Gpr177 CKO糖尿病小鼠DRG中WNT5a的表达和分泌情况。Wnt5a mRNA的转录在WT和Gpr177 CKO糖尿病小鼠DRG中均有上调；然而，WNT5a蛋白的表达仅在Gpr177 CKO糖尿病小鼠DRG中上调。如预期所料，WNT5a蛋白在WT糖尿病小鼠脑脊液中高度升高，而在Gpr177 CKO糖尿病小鼠脑脊液中WNT5a蛋白缺失。
此外，通过对两种小鼠的DRG进行培养，观察到WT糖尿病小鼠DRG的培养基中WNT5a分泌增加，而在Gpr177 CKO糖尿病小鼠DRG的培养基中则没有检测到。相比之下，WNT5a在Gpr177 CKO糖尿病小鼠DRG培养的裂解产物中表达更高，表明Gpr177敲除导致WNT5a的分泌失败。这些结果提示，GPR177能够调控糖尿病小鼠DRG神经元向脑脊液分泌WNT5a。
3. DNP的形成依赖于DRG神经元中的WNT5a信号
为了确定分泌的WNT5a是否在DNP的形成过程中发挥作用，研究者通过在鞘内给予WNT5a的特异性拮抗剂Box5或其中和抗体anti-WNT5a来拮抗WNT5a的作用。鞘内给予Box5改善了糖尿病小鼠的机械性痛觉过敏，并呈现剂量依赖性；同样，鞘内给予anti-WNT5a抗体也逆转了糖尿病小鼠的机械性痛觉过敏。研究者进一步通过膜片钳记录到，Box5能够逆转糖尿病小鼠痛觉神经元（小直径或TRPV1+）的高频放电以及较低的基强度。这些数据表明，分泌的WNT5a促进了STZ诱导的神经病理性疼痛和痛觉神经元的高兴奋性。
为了进一步验证DRG神经元中的WNT5a是否是DNP的形成所必需的，研究者通过鞘内注射AAV病毒条件性地敲除DRG神经元中的WNT5a，来观察其对STZ诱导的神经病理性疼痛的影响。敲除Wnt5a基本上消除了STZ诱导的小鼠机械性痛觉过敏。在PEA测试中，机械刺激诱导WT糖尿病小鼠表现出明显的厌恶反应，而在Wnt5a CKO小鼠中则不存在。此外， Wnt5a敲除还缓解了糖尿病小鼠外周神经末梢 IENF病变。这些数据表明，DRG神经元中的WNT5a促进了糖尿病小鼠神经病理性疼痛以及周围神经病变。
4. WNT5a通过激活DRG痛觉神经元和增强脊髓兴奋性突触传递来诱发DNP症状
作者接下来探讨了WNT5a是否能够以及如何诱发DNP。鞘内注射极低剂量的外源性WNT5a可诱导非转基因小鼠发生机械性痛觉过敏，以及PEA测试中类似于DNP的厌恶反应。鉴于WNT5a/Ca2+信号通路在提高神经元兴奋性中的作用，作者推断WNT5a诱发DNP症状可能是由于WNT5a/Ca2+信号通路增强了神经元的兴奋性所致。钙成像显示，WNT5a能够诱导DRG培养神经元胞内Ca2+（iCa2+）快速强烈升高，其反应呈WNT5a剂量依赖性。此外，这种对WNT5a有反应的神经元同样对辣椒素也有反应，辣椒素是TRPV1的一种强效激动剂，而TRPV1又是DRG痛觉神经元的一种特异性标记物。作为对照，高剂量的WNT3a和变性的WNT5a均不能诱导这种快速的Ca2+内流，提示WNT5a在激活DRG痛觉神经元中具有特异性。
膜片钳记录进一步显示，WNT5a可诱导DRG小直径神经元自发放电和快速内向电流，它们中的大多数同时也对辣椒素有反应。值得注意的是，尽管WNT5a的剂量要小得多，其引起的内向电流的幅值与辣椒素所诱导的幅值类似。考虑到脑脊液中存在分泌的WNT5a，作者也明确了WNT5a在脊髓痛觉传递中的作用。脊髓中表达生长抑素（Somatostatin+, SOM+）的兴奋性中间神经元构成了脊髓机械痛觉传递环路的基础，同时能够调节触摸和疼痛通路之间的相互交流。全细胞膜片记录显示，WNT5a能够提高脊髓中SOM+中间神经元的自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）的频率，但是不会改变它的幅值。
总之，这些结果表明，WNT5a可能通过直接激活DRG痛觉神经元和增强脊髓中兴奋性突触传递来诱发DNP症状。
5. WNT5a能够选择性激活TRPV1通道，诱导TRPV1单通道活动
接下来，作者试图了解WNT5a激活DRG痛觉神经元并促进神经元兴奋性的机制。TRPV1和TRPA1通道是DRG中与痛觉信号密切相关的离子通道，并且与DNP有关。考虑到WNT5a可选择性的去极化辣椒素响应神经元，并在数秒内诱发放电，作者推断WNT5a可能直接作用于TRPV1通道。与预期一致，钙成像结果显示，WNT5a在表达TRPV1的HEK293T细胞中能够诱发胞内Ca2+明显升高，但在转染空白对照、Trpa1或Trpm8质粒的HEK293T细胞中没有观察到这种变化。全细胞膜片钳记录显示，WNT5a在表达TRPV1的HEK293T细胞中诱导了快速强烈的内向电流，而在表达TRPV2、TRPV3或TRPA1的HEK293T细胞中没有诱导出该内向电流。这些结果表明，WNT5a可以选择性地激活TRPV1通道。
为了证实WNT5a能够直接激活细胞表面的TRPV1，研究者对表达TRPV1的HEK293T细胞进行了单通道记录。利用膜外面向外的记录方式，研究者记录到给予WNT5a可诱发膜表面的TRPV1单通道开放。而空白细胞或表达TRPA1的HEK293T细胞中未能引发单通道开放事件。并且给予SB366791（TRPV1阻断剂）能够阻断WNT5a引起的TRPV1单通道开放。此外，作者证实了WNT5a诱导的单通道电流的幅值与跨膜电压呈线性相关，这与之前报道的TRPV1激活一致。综上所述，WNT5a能够直接激活TRPV1通道。
6. WNT5a诱导的TRPV1激活对DNP的形成至关重要
接下来，作者探讨了WNT5a诱导的TRPV1激活是否是DNP的形成所必需的。为此，研究者设计了多种阻断肽来阻断WNT5a诱导的TRPV1的激活。其中，阻断肽AA601-25可以通过剂量依赖性的方式来缓解WNT5a诱导的机械性痛觉过敏。并且AA601-25能够减少WNT5a诱导的DRG神经元iCa2+反应，而不会阻断其对辣椒素的反应。这些结果表明，AA601-25可以阻断WNT5a诱导的TRPV1激活，而不损害TRPV1通道功能。为了进一步确定WNT5a诱导的TRPV1激活与DNP病理的相关性，作者检测了阻断肽在DNP中的作用。鞘内给予AA601-25可以有效缓解糖尿病小鼠的DNP。此外，在Trpv1-/-小鼠中，鞘内给予WNT5a或者通过STZ诱导均不能引起机械性痛觉过敏；同时，WNT5a以及STZ引起的DRG神经元兴奋性增加在Trpv1-/-小鼠中也被逆转。总的来说，这些数据表明，WNT5a诱导的TRPV1激活对糖尿病小鼠DNP的产生至关重要。
7. GPR177/WNT5a在人DRG神经元中表达，DNP患者脑脊液中WNT5a含量升高
为了确定该研究的发现是否具有临床治疗潜力，研究者检测了临床患者DRG样本中Gpr177和Wnt5a mRNA的表达。原位杂交显示Gpr177主要表达于人源DRG的大直径神经元中（NF200+）。Gpr177 +神经元中，大约80%的神经元与Wnt5a共表达。因为只有25 ~30%的糖尿病患者发展为DNP，因此作者比较了有无DNP的糖尿病患者脑脊液中WNT5a的含量。与无DNP患者相比，DNP患者脑脊液中WNT5A蛋白升高了10倍。作者进一步分析了糖尿病患者脑脊液中WNT5a的含量与剧烈疼痛的关系，其Pearson相关系数为0.91，表明疼痛强度与脑脊液中WNT5a含量呈强正相关。此外，WNT5a还可以激活人源TRPV1通道，在转染人源TRPV1的HEK293T细胞中诱导内向电流。综上所述，这些结果证实了GPR177/WNT5a在人的DRG神经元中表达，以及DNP患者脑脊液中WNT5a的含量升高，提示GPR177-WNT5A-TRPV1信号可能与DNP的形成相关。
总结
该研究揭示了DRG神经元中的GPR177-WNT5a-TRPV1信号参与糖尿病小鼠DNP发病的作用机制。值得注意的是，GPR177和WNT5a都是高度保守的，活性WNT5a的蛋白序列在小鼠和人体内完全相同。该研究发现DNP患者脑脊液中分泌的WNT5a增加，提示其与临床DNP的相关性。因此，使用选择性的拮抗剂或特异性的中和抗体来靶向WNT5a可能是缓解糖尿病患者DNP的一个潜在治疗策略。
亮点研究方法
