12个常见问题，解决你对光纤记录实验的常见困惑！

作者：RWD

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技术干货

动物行为评估

光纤记录技术本身相当复杂，涉及光学、材料、数据处理等多方面知识，这使得实验人员在设计和操作实验时容易产生疑问。

下面总结了一些光纤记录实验常见的问题，希望能为您的研究工作提供帮助。

Q1光纤记录系统能否做多只动物实验？

多通道光纤记录系统主要针对于多个脑区同步记录，可以采用接入一分多光纤对多只动物或者动物的多个脑区进行同步记录实验。

Q2光纤，插针实验前需要擦拭吗？

需要。动物头部的陶瓷插针很容易沾上脏东西，光纤的端面在人手触摸的时候也会产生脏污，这些脏污会影响信号传输，从而影响实验记录。

建议实验开始使用酒精将光纤两端及动物头部的陶瓷插针擦拭一遍。

Q3光纤记录实验是否都需要注射病毒？

不一定，常规操作是注射带有特定启动子的病毒，从而通过病毒转染特定的细胞。但是也可以通过转基因动物杂交从而将特定细胞标记上荧光蛋白。目前已有成品化的Gcamp小鼠。

Q4光纤记录实验常见参数的设置范围

光纤末端功率，每个通道大概20微瓦到60微瓦之间就可以，功率过强会导致荧光信号漂白；同一个实验中，参考光源与激发光源可以处于相同的输出功率，只要不影响数据观察，参考光源功率不需要设置太高。

采集帧率一般选择40，60，100，最高120fps，因为钙信号的变化时间范围在ms级别，所以不需要过高采集频率。增益一般设置为1 ，增益增大会同步将所有信号增强，噪音信号也会增强。

Q5光纤记录系统中常见参数帧率，采样率如何判断优劣？

光纤记录信号采集帧率常用赫兹（Hz），帧率（FPS）表示，主要意思就是指的采集器可以在一秒时间内采集多少次数据，例如RWD光纤记录R811、R821光纤记录系统最高采样帧率为250FPS，代表一秒内可以采集不少于250次荧光信号。

采样越高代表可采集到的数据点越多，能够反应的信号细节越多，此外三色光纤记录系统中包含三个激发光（410nm+470nm+560nm），三种激发光为了保持相对独立，会采用交替激发的实验模式；
交替激发下，选择60FPS进行实验，其中410/470/560光源各闪烁20次，每个激发光各自产生20个有效数据点。所以高帧率可以对于多色的实验需求更加符合。并且高帧率也是相机品质的一种体现，满足高帧率的相机性能也会更好一些。

但是实验中我们不推荐直接使用过高的帧率进行实验，原因如下：

第一，帧率越高，曝光时间越短，可能会导致信号幅度较低（类似于照片曝光时间短，图像偏暗不清晰）；

第二，过高帧率下，细胞受到的单位时间内的激发光能量较高，容易导致荧光信号被漂白（信号会越来越弱）。

Q6双色/三色多通道光纤记录系统最多能同时做几只动物？多只同时做的时候信号会不会干扰，激发光强会不会受到影响？

最多可做9只，是通过一根多分支的光纤来完成的，多只动物或者多个脑区都是用那种Branching optic fiber来做的，Branching optic fiber其中的分支从头到尾都是相互独立的（如下图）。

然后每个光斑都会投射到CMOS相机靶面的不同位置，通过设置不同的ROI采集区域来分别采集每个通道的光信号。从接口到出光口都是相互独立的，激发光的强度可以调节的，这个没啥影响的。

12个常见问题，解决你对光纤记录实验的常见困惑

Q7410nm激光作为对照的原理和功能？

在光纤记录实验中，会出现人为引入的噪声(Artifacts)影响，包括:组织损伤引起的自发荧光(Autofluorescence)，动物自由活动引发的运动噪声(Motion-Induced Changes)，长时间成像诱发的光漂白 (Photobleaching)，以及其他非钙浓度变化引起的假阳性信号干扰等。

410nm激光不会对荧光蛋白的信号产生影响，但是可以反应上述干扰因素的信号变化，所以410 nm 激发所对应的荧光信号变化可以反映背景噪声信号。

Q8光纤记录系统用于记录神经递质信号的原理？

已知的大部分神经递质都有相应的G蛋白偶联受体（GPCR）作为受体，使用遗传学方法将荧光蛋白与受体结合。

受体与配体（神经递质）结合后的构象变化与荧光蛋白的荧光信号变化相偶联，一旦特定神经递质释放激活受体并使之发生构象改变，此种构象改变会引起与之相连的荧光蛋白也发生构象改变，最终改变其荧光强度。

因此，可以利用荧光蛋白的荧光强度变化来指示神经递质的浓度的动态变化。

Q9光纤记录实验中常说的df/f，z-score，Heat map，事件曲线等代表什么？

df是统计学里面的说法，可简单将df/f理解为荧光相对增长幅值（相对增长百分比），z-score与df/f表示相同的意义，只是数据算法不一样，z-score数据是在df/f的数据基础上再使用标准分数计算公式进行计算的。

heat map：用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息，直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。如下图所示，荧光热图可以清晰看到不同组的动物数量和事件数量。

事件曲线：常用Mean±sem表示，Mean±sem：均值±标准误（如下图所示），df/f曲线中中间较深的线就是均值（Mean），曲线上下的颜色区间代表bar值，也就是sem标准误。事件曲线更为清晰直观，可直接观察到不同组之间的差别。

Q10光纤记录系统使用普通光纤与低自发荧光光纤的差别

普通光纤使用前需要用光纤漂白器进行漂白，每次漂白时间为1.5小时以上，漂白后可以减少50%-75%的自发荧光，但是自发荧光会随着时间逐渐恢复，所以下次使用之前需要重复漂白，相对来说此种光纤的成本低。

低自发荧光光纤采用低自发荧光材料制作而成，整体的自发荧光值就很低，实验中不需要重复漂白，低自发荧光光纤普遍售价较高。在检测一些较弱信号情况下，低自发荧光光纤更具有优势。

Q11光纤记录系统与钙成像微型显微镜区别

光纤记录系统记录的是钙信号或者神经递质信号的变化幅度，输出的结果是变化曲线和幅度阈值等；

微型显微镜通过直接在大脑区域埋置透镜，直接将细胞的荧光变化以成像的方式进行记录，输出的数据是细胞荧光信号变化的图片或者视频。

Q12光纤记录的应用场景有哪些？

１.学习记忆：AD，衰老等；

２.精神疾病：抑郁症，癫痫、精神分裂症等；

３.运动障碍：PD，亨廷顿等；

４.成瘾奖赏：吸毒，药物或酒精成瘾，致敏等；

５.其他：疼痛，炎症，觉醒等。

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