实操技巧：大小鼠脑组织冰冻切片操作步骤

在对脑组织进行免疫染色或原位杂交等实验前，需对实验动物组织（如大小鼠）进行切片处理，冰冻切片常常是研究人员的首选。原因是对比石蜡切片，冰冻切片无需脱水、透明、浸蜡等复杂的前处理过程，细胞可避免抗原活性损伤，操作又快又简单。

小鼠脑组织冷冻切片操作步骤

（*大鼠操作步骤与小鼠相同，本文以小鼠为示例）

1 小鼠灌注固定

小鼠经麻醉后开胸暴露心脏，经左心室先快速灌注生理盐水约50ml至流出液变清亮，换4%多聚甲醛继续灌注约100ml至组织变硬。

2 取材脱水

剥离脑组织，置广口瓶中用4%多聚甲醛在4℃条件下后固定12-24小时。将标本转入10倍体积的30%蔗糖溶液（用4%多聚甲醛配制），4℃脱水至组织沉底，成年鼠脑通常需要2天，幼年不带颅骨的鼠脑通常需要1天，带颅骨则需更久。

3 设置冷冻切片机温度

（*实操步骤以瑞沃德Minux®冷冻切片机为示例）

箱体温度设置为-20℃，样品头温度设置为-22℃（可按实际切片情况调整）。

4 冷冻样品包埋制备

（1）取出脱水后的脑样品，用生理盐水清洗后，吸水纸吸干。

（2）然后开启快速制冷，将样品托放速冻位点，涂一层OCT包埋剂，覆盖样品托凹槽，用冷锤压平，制作一个基座平台。

（3）将鼠脑腹侧向下平放在基座中心，从鼠脑中央均速滴入OCT至鼠脑完全覆盖。若鼠脑位置变动，可用镊子调整，冷冻至OCT完全凝固。

注意事项：

鼠脑表面必须完全干燥，表面遗留30%蔗糖将导致切片时OCT与样品分离。OCT中不能有气泡，特别是样品附近的气泡会影响冰冻切片效果。

5 冷冻切片

（1）将放在箱体内预冷的刀片安装在刀架上。

（2）松开样本头上的锁杆，根据可视指针标识可以快速精准调节样本头角度，角度调节好后重新锁紧锁杆。

（3）顺时针扳动样本头左侧手柄可将样品托固定在样本头上，卡上即可。

（4）将修块厚度设置为50-100μm，去除多余的OCT（此时不需要放下防卷板），直至接近样品，通常能看到一点肉色透出。修片的同时可再次调整角度，获得合适的切面。

（5）根据实验需求设置切片厚度。RNA原位杂交用贴片通常设为12-20μm；免疫组化用漂片通常设为30-50μm，贴片通常为20-30μm。

（6）放下防卷板，微调后方黑色旋钮调整防卷板前后位置，使得切下的切片平滑进入防卷板之下的间隙并被压平整。

（7）若采取漂浮收片，需预先准备加有PBS的24孔或48孔板。使用小毛笔将脑片转移到PBS中，按顺序收取。板子的盖子和侧面均应标注，避免盖板分离，样品混淆。若采取贴片，需使用带正电荷的防脱玻片，将脑片平整的贴在玻片上。

6 注意事项

（1）检查刀片和防卷板有无豁口，若有需避开或更换。

（2）调节距离时避免快速撞击防卷板或刀片，避免产生豁口。

（3）贴片前注意检查玻片的洁净程度，若有明显杂质附着，需要更换或处理后再使用。

（4）预先在玻片有色端做好标注，以免出错。

（5）切片时若出现脑片碎裂，说明样品温度过低；若出现卷片粘连，说明样品温度过高。应相应调整箱体和样本头温度，优化切片效果。

（6）冷冻切片机有自动除霜和自动消毒功能，不能将冷冻切片机当作冰箱保存组织标本。