如何在免疫组化冰切中减少冰晶的形成?

如何在免疫组化冰切中减少冰晶的形成?

作者:RWD
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在免疫组织化学染色中,冰冻切片是被研究人员使用最多的一种切片方法。原因是这种切片方式能够较完好地保存各种抗原的免疫活性及酶类,特别是对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存;而且对组织存储的形态没有限制,新鲜组织和已固定的组织都可使用冰冻切片。


如何在免疫组化冰切中减少冰晶的形成?


然而在使用冰冻切片时,组织中的水分易形成冰晶,特别是在含水量较多的组织中更容易发生。严重的冰晶状况(如小而多),会刺破细胞,破坏组织形态,影响抗原定位。


肾脏组织,无冰晶

(▲肾脏组织,无冰晶)


肾脏组织,大量细胞外冰晶

(▲肾脏组织,大量细胞外冰晶)


冰晶是如何形成的呢?


冰冻切片中按照冰晶形成在细胞内外的位置不同,表现形式有细胞外冰晶、细胞质内冰晶、细胞核内冰晶。在冰冻切片中,细胞外冰晶是冰冻切片中最多见的,各种组织均可以出现。


冰晶形成的原因是组织冷冻速度太慢。冰冻开始时,冰晶成核率较慢,以后逐渐增加,其临界温度为-33℃,从-30℃降至-43℃之间,成核率急剧增加,然后再减慢。冰晶的大小与其生长速率成正比,而与成核率(形成速率)成反比,即冰晶形成的数量愈多则愈小,对组织结构影响愈严重。因此,应尽量降低冰晶的数量。要减少冰晶形成,组织冷冻的方式和操作流程至关重要。


如何解决冰晶问题,提高切片质量?


可采取速冻措施减少冰晶的形成,使组织温度骤降,缩短温度下降(-33℃~ -43℃)所需时间,从而减少冰晶的形成。目前已知的方法有:

  • 使用液氮;这种可快速冷冻组织,有效减少冰晶形成。但因技术成本和管理成本高,使用过程安全性不高,存在生物安全问题等因素,没有被广泛运用。
  • 采用半导体制冷技术;瑞沃德Minux®智能恒温冷冻切片机使用该技术,一键启动快冷模式,设备自动开启固定吸热块,可在1-3分钟内把温度降至-55℃~-60℃。


快速冷冻组织操作流程


01

开启快冷功能

开启快冷功能


02

预冷

将样品托放快速冷冻位点预冷,加上适量OCT包埋剂


03

放上组织

等OCT包埋剂降温底部变白,放上组织。


04

压上固定吸热块

立即压上固定吸热块


05

制备完成

移走吸热块,样品制备完成


*注意:

  • OCT包埋剂影响组织冷冻速度,使用须适量。
  • 冷冻过组织的固定式吸热块,必须放在速冻台上再次降温后使用。
  • 可将组织置于20%、30%蔗糖溶液梯度脱水,利用高渗吸收组织中水分,减少组织含水量。


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