病理组织固定中4类难点问题及应对方法

组织固定是组织病理学中的基本操作步骤，只有经过固定，才能完成随后一系列的制作，直到切片的最后完成。但在日常的病理制片中，经常发生因固定不好出现各种问题，本期我们总结了4个组织固定常见问题并提供参考方法，期望能给广大病理工作者日常工作带来些许启发。

一、固定液使用时有哪些基本原则和注意事项？

1、选择合适容器。一般容器的容积是组织的10~15倍以上，以瓶口较大的为宜，便于标本放取。

2、固定时间要足够。根据标本体积大小不同，固定时间应有所不同，组织越大越厚，固定时间应越长。一般4~12小时或更长。在温箱内将固定液稍加温，可使固定作用加快而缩短固定时间。

3、固定液要足量。一般应为组织体积的5~10倍，多比少好。标本最好悬浮于固定液中，漂浮于固定液之上或沉于底部都不利于固定液渗入。标本块多时，固定时不应重叠。不要先将标本放入容器后再注入固定液，以免标本粘附，固定不均匀。新鲜标本应及时固定，否则或因组织陈旧，或因固定不当，使组织原有结构消失而影响观察。

4、对于某些需要制作神经染色和酶反应等组织的固定，要求较一般严格，组织大小、固定时间、温度的适当都应慎重考虑，尤其是对于酶反应的固定液，一般都要置于冰箱，在低温的条件下进行固定。固定不好，是得不到满意的切片和合乎标准的反应效果的。

5、任何固定液对人体都有损害作用，因此固定液的容器必须密闭，以防挥发损伤器官和眼睛，忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。

二、病理标本固定不良该如何补救？

1、把已包埋的固定不良的组织重新放入石蜡中融蜡，使组织周围多余的蜡去除

2、把已除去石蜡的组织放入二甲苯Ⅰ（或环保脱蜡剂）中30分钟，二甲苯Ⅱ30分钟，以去除组织内含有的石蜡。

3、把经过两道二甲苯的组织重新逐级放入乙醇。

4、无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇中各20分钟，此过程应注意各级乙醇应是初次使用，而且不可重复使用，以免已脱蜡的组织又重新沾上乙醇中含有的蜡。

5、如为胃镜取得小标本，组织已干枯，应在以上程序后水化，应放1%~2%冰醋酸内使组织软化后重新水洗，水洗时间视标本大小确定。

6、把经过各级乙醇浸泡得组织重新放入70%甲醛乙醇溶液中固定。

7、把经过二次处理的组织和下一批标本一起放入脱水机内常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。

三、在免疫组化技术中固定液应如何选用？

免疫组化染色标本在取材后需立刻投于固定剂中，使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态，原位保存抗原，避免抗原失活或弥散。常用固定液：

1、醛类：甲醛应用最广，优点是形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少，缺点是放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色。注意缩短固定时间，降低固定温度（4℃），为此组织块不宜过厚。改用中性缓冲甲醛溶液，以pH7.2~7.4浓度0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液，减少固定液pH的变化。

戊二醛优点穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

多聚甲醛（常用4%）可用于免疫电镜，也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能较弱的抗原特别是细胞表面抗原，对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保持较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好，适用于免疫组织化学染色，但固定时间宽容度小，以24小时以内为宜。

2、醇类：最常用乙醇，使细胞内蛋白、糖类发生沉淀，穿透性强、抗原性保存好，但脱水性强，易引起组织收缩变硬，影响切片质量，所以固定时间不宜过长（2小时内）。乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

3、丙酮对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。

四、特殊组织的固定有什么需要注意的吗？

以上就是本期小沃与大家分享的组织固定问题及参考方法，希望能帮到您。