为什么老年人神经损伤后难以恢复？可逆的CD8+ T细胞与神经元交流导致衰老依赖的神经再生衰退

核心观点

1、衰老与小鼠SNI损伤后DRG中T细胞活化信号的显著升高有关，这些淋巴活化信号激活了转录因子NF-κB，诱导神经元表达趋化因子CXCL13；
2、SNI损伤后，DRG中受损神经元分泌的CXCL13能够募集CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞向受损后过表达MHC Ⅰ的神经元附近迁移；
3、CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞与过表达MHC I的神经元交流激活了Caspase-3，从而损害了pAKT和pS6信号，导致轴突再生失败；
4、通过药理学手段拮抗Caspase-3信号的激活，逆转了老龄动物的轴突再生失败，并恢复了pAKT和pS6的表达；
5、中和CXCL13可阻止CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞的募集，逆转了衰老依赖的神经再生能力衰退，从而促进SNI后的神经功能恢复。

研究结果分析

1. 衰老导致DRG稳态和神经损伤后适应性免疫基因谱出现广泛变化

在坐骨神经损伤（Sciatic Nerve Injury, SNI）之前（假手术）或之后（SNI），分别对8~10周龄（年轻）和20~22月龄（老年）小鼠的DRG进行RNA-seq检测。与年轻假手术小鼠相比，年轻的SNI小鼠DRG中观察到的神经发育、神经递质、离子转运、G蛋白偶联信号和信号转导等基因表达下调，而在老年的SNI小鼠中未观察到。衰老的DRG中适应性免疫反应相关基因的表达显著富集，特别是在SNI后，T细胞和细胞因子/趋化因子信号显著升高。

2. 在衰老DRG中，神经元CXCL13和CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞显著升高

CXCL13是SNI后上调最显著的基因。在衰老的DRG中，CXCL13受体CXCR5的表达也显著增强，提示存在CXCL13-CXCR5信号轴。当衰老的DRG神经元的再生减少时，CXCL13的表达在SNI损伤前和损伤3天后均显著增加。尽管CXCL13在坐骨神经损伤部位也有表达，但是并未观察到衰老相关的变化。在SNI损伤后的第3天，衰老DRG中的CXCL13蛋白水平相对于年轻DRG也有显著增加。

由于CXCL13是CXCR5⁺ B细胞和T细胞的趋化因子，研究者接下来评估了SNI后3天内年轻或老年小鼠DRG中B细胞和T细胞的定位和免疫表型。衰老DRG中的CXCR5⁺ B细胞、CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞、以及CD4⁺ T细胞明显增多。相当比例的CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞为CD44⁺ CD69⁺ CD62L^-，提示它们是效应记忆性T细胞，而只有一个非常少的CD8⁺ T细胞或CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞为CD103⁺和P2RX7⁺，表明这些细胞是迁移表型而非组织驻留表型。大约一半的CD8⁺和CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞也表达CXCR6，表明这些细胞具有滞留和有限再循环的能力。
老年小鼠血液中初始T细胞的总百分率降低，而记忆性CXCR5⁺ T细胞的百分率显著升高。CD8⁺ T细胞的数量，包括CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞，再衰老DRG中显著增加，并且在SNI损伤3天后进一步增加。所有CD8⁺细胞均为CD68⁺以及CD3⁺细胞，这表明它们是T细胞而非巨噬细胞。此外，衰老DRG 中B细胞的数量在SNI损伤后显著增加，但这些细胞DRG实质外，可能是存在于周围小静脉中。因此，衰老与SNI前后神经元的CXCL13表达增加、CXCR5⁺ T细胞的募集活化、以及T细胞向DRG实质迁移有关。

3. 神经元分泌的CXCL13足以招募CXCR5⁺ B细胞和T细胞到DRG，并损害轴突再生

接下来，研究者探讨了神经元CXCL13的分泌以及它的过表达是否足以将CXCR5⁺ B细胞和T细胞募集到DRG中。研究者利用AAV病毒转染培养的DRG神经元，使其过表达CXCL13，并收集培养液用于随后的体外脾细胞迁移实验。过表达CXCL13的培养基增强了CXCR5⁺ B细胞和T细胞的募集。
为了研究CXCL13的表达是否会影响轴突再生，研究者在体内DRG神经元中过表达CXCL13，并通过干扰素γ（Interferon-γ, IFN-γ)和甘露醇分别诱导MHC Ⅰ的表达和增强血液-DRG屏障的能力，随后立即进行SNI实验。与对照相比，过表达CXCL13的DRG中CXCR5⁺ B细胞和CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞均显著增加。过表达CXCL13后坐骨神经轴突再生显著减少。
因此，DRG神经元表达的CXCL13可以招募CXCR5⁺ B细胞和T细胞，并可以抑制轴突再生，部分复制了衰老表型。

4.衰老DRG中CXCL13的表达依赖NF-κB的磷酸化

为了确定转录因子（TranscriptionFactors,TFs）是否参与驱动衰老依赖的CXCL13表达，研究者分析了促进CXCL13表达的TFs在衰老DRG中的表达情况。在已知的与CXCL13启动子结合的TFs中，只有NF-κB2在衰老DRG中显著上调。随后，研究者用典型的NF-κB激动剂（TNF-α或IL-1β）和非典型的NF-κB激活剂（BAFF或LTα1β2）来处理培养的DRG神经元24小时。TNF-α和IL-1β能够上调NF-κB1和NF-κB2的表达，但不能上调CXCL13的表达，而BAFF既不影响NF-κB的表达也不影响CXCL13的表达。然而，非典型的NF-κB激活剂LTα1β2能够显著增强NF-κB2和CXCL13的表达，这种作用可以被NF-κB激酶IKK的抑制剂PS1145减弱。NF-κB的表达和磷酸化均随衰老而增加，但相对于对照，PS1145抑制了NF-κB的磷酸化。因此，衰老诱导的CXCL13的表达在PS1145中也显著降低。此外，对磷酸化的NF-κB进行免疫组化染色显示，磷酸化的NF-κB在SNI前和3天后在DRG神经元内定位，并衰老的DRG神经元中显著增加。因此，年龄相关的CXCL13表达是由NF-κB驱动的。

5. CD8⁺ T细胞和神经元中MHC I的表达是衰老依赖的神经损伤再生衰退所必需的

接下来，研究者探讨了CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞或B细胞是否参与了老化DRG神经元轴突再生的衰退。在老年小鼠SNI前1周，用CD8α单克隆抗体来耗竭CD8⁺ T细胞，小鼠SNI手术后，其轴突再生能力得到显著改善，DRG中CD8⁺ T细胞显著减少。相比之下，CD4⁺ T细胞或B细胞的耗竭并没有改变老年小鼠SNI后衰老相关的轴突再生衰退。这些数据表明CD8⁺ T细胞在老年动物SNI后的轴突再生能力下降中起着重要作用。
RNA-seq显示，SNI后MHC I的表达与年龄相关。与年轻对照相比，衰老DRG中MHC I的表达在SNI前后显著增。随后，研究者探讨了CD8⁺ T细胞是否是为限制MHC I表达的DRG神经元轴突生长所必需。利用IFN-γ能够诱导MHC I在DRG神经元中表达，TCR转基因的OT-I CD8⁺ T细胞在卵清蛋白肽（OVA_257–264）存在时能够有效的降低这些表达MHC I的神经元轴突生长、同时增加Cleaved Caspase-3水平，但没有增加其它凋亡特征。因此，DRG神经元的轴突生长减少依赖神经元MHC I的表达和OT-I抗原特异性的CD8⁺ T细胞。
接下来，研究者探讨了MHC I依赖性的抗原递呈在衰老小鼠的轴突再生衰退中是否必要。为此，研究者利用AAV-GAr-rtTA病毒在衰老小鼠DRG中条件表达编码的甘氨酸/丙氨酸多肽序列GAr，该序列可抑制MHC I抗原递呈，从而避开CD8⁺ T细胞的免疫反应，然后进行坐骨神经损伤。与对照相比，AAV-GAr-rtTA感染后神经元的MHC I和Cleaved Caspase-3表达显著降低，坐骨神经轴突再生显著增强。因此，SNI后衰老相关的神经再生衰退依赖于CD8⁺ T细胞和神经元MHC I的表达。

6. CD8⁺ T细胞依赖的神经元Caspase-3激活抑制了pAKT和pS6信号，这与衰老相关的轴突再生失败有关

这项工作阐述了衰老依赖的神经再生失败的细胞分子机制。研究用到了动物手术造模、组织病理检测、细胞分子检测、给药以及行为学评估等实验技术。瑞沃德深耕生命科学研究领域20年，一直致力于为客户提供可信赖的解决方案和服务，可提供的该研究中涉及的动物手术造模、行为学评估、光遗传学、电生理记录、组织病理检测、给药以及分子检测等实验的完整解决方案。截至目前，瑞沃德产品及服务覆盖海内外 100 多个国家和地区，客户涵盖全球700+医院，1000+科研院所，6000+高等院校，已助力全球科研人员发表SCI文章14500+，获得行业广泛认可。