免疫组化技术专题第1期之什么是免疫组化染色技术？

免疫组织化学技术（下列简称“免疫组化”），作为现代生物学领域中一项不可或缺的研究手段，在基础医学研究和临床病理诊断中起到决定性作用。

同时，近年来越来越提倡免疫组化技术标准化和实验操作规范的重要性。全面熟练免疫组织化学的技术方法，并制作出一流的免疫组织化学染色切片，是病理医生首要且必须要掌握的核心技术。

我们特别开设“免疫组化技术专题”，以期助力更多病理同仁系统地了解该前沿技术。本期详细介绍免疫组化染色操作步骤和关键物质两方面，赶紧收藏学习吧~

冰冻切片的免疫组化染色操作步骤：

1、新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可- 80℃保存)，厚度为5~6μm。

2、载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3、如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4、染色前用冷丙酮在4℃固定 10-20分钟。

5、PPS洗2次，每次5分钟(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)。

6、3%H₂O₂灭活内源性过氧化物酶，20 分钟，避光。

7、用PBS洗2次，每次5分钟。

8、正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗体同源动物血清)处理，37℃ 15 分钟。

*附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

9、滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。

10、PBS：5 分钟 2 次(置于摇床) 。

11、滴加生物素化的二抗，37℃ 40 分钟。

12、PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

13、滴加三抗 (SAB 复合物) ，37℃ 40 分钟。

14、PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

15、DAB 显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止) 。

*附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3%H₂O₂ 5μl。

16、自来水(细水)充分冲洗。

17、苏木素复染，室温 30 秒，自来水冲洗。

18、自来水冲洗返蓝 15 分钟。

19、梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。

20、二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各 5 分钟。

21、封片：加拿大树胶(或中性树胶)封片。

接下来，介绍免疫组化染色过程中的关键物质：

抗体。抗体是免疫组化的关键物质。为了更好地掌握免疫组化染色的方法，及解决其过程中遇到的问题，我们需要掌握有关抗体的基础知识，认识抗体的特性和局限性，这将会助力大家的染色切片获得预期效果。

酶。我们通过酶和底物的通用分子式来理解免疫组化的染色原理：1.酶(E)+底物(S)=ES复合物；2.ES-E+产物(P)。此为酶-底物反应使无色的色原转化为有色的产物的方法。同时酶的活性还受到酶和底物的浓度、PH度、温度和光照、缓冲液的盐浓度等因素影响。

甲醛。众所周知，甲醛作为常用固定液用于组织固定，会造成许多抗原的免疫活性丢失，从而导致免疫组化染色失败，这里就涉及到抗原修复，目的是为了更好地恢复组织细胞的免疫活性。

免疫组化技术是一项多步骤的染色技术，需要在组织处理、试剂选择和组织切片染色结果评判等方面进行特殊训练。免疫组化染色技术最后产生可见的抗原，是经过了特异性抗体对抗原的反应，第二抗体对第一抗体的反应以及酶复合物和色原底物反应一系列的作用，色原的酶反应活性才最后导致了可见的反应物出现在抗原位置。由于该技术的高度复杂性，预计不到的阴性反应，不合意的特异性染色和不合意的背景染色的原因有时是难以明确的。

免疫组化染色技术比较复杂，难以掌握，瑞沃德将结合“行业大拿”、前人经验和自身经历来跟大家做后续交流，我们下棋见。