免疫组化技术专题第4期之固定、浸蜡和烤片
免疫组化的染片结果影响着病理诊断的判读。但是免疫组化染色流程操作复杂，其中需要经过切片制作（固定，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，贴片，烤片）、脱蜡、水化、阻断、抗原修复等上十余种操作步骤，在每一步操作步骤中，都可能存在影响免疫组化染色结果的因素。本期我们将讲解切片制作步骤中的固定、浸蜡和烤片，对免疫组化染色结果的影响。
固定
及时、充分的固定是高质量免疫组化染色结果的保证。固定是为了最大限度地保存组织内部的抗原性。
固定原则：在保持细胞形态和所测抗原性的前提下，采用尽可能低浓度的固定液和最短固定时间，要求组织离体后尽快放入固定液或低温保存，并针对抗原特性选择最合适的固定剂。
固定液的选择：目前最佳的免疫组化固定剂是FineFIX 固定液。虽然10%缓冲甲醛溶液或多聚甲醛最为常用，其可做抗原修复，但甲醛对保存IgG抗原方面较差。
另外样本组织块在前处理阶段的不当操作会导致内部抗原发生改变，从而导致染色强度的强弱或阳性表达率减少的状况层出不穷。首先考虑的是浸蜡温度，和烤片温度的影响。
烤片
烤片的目的，一是方便脱蜡，二是将组织切片牢固地附贴于玻片上，以防止在整个染色过程中出现脱片情况，以及能让经烤片后的组织切片中的免疫反应活性能在常温下保存长久。
实验表明，浸蜡温度在80℃超过16小时的组织在免疫组化染色表达时，其阳性表达及阳性率均有明显的减少。以下是各类常见组织适宜的烤片温度及烤片时间参考：
浸蜡
在实验中不难发现，组织浸蜡的温度及时间长短对免疫组化染色结果的影响并没有像烤片那么大，这与组织浸蜡时一般为隔水加温法有关。文献报道当因高温浸蜡影响了免疫组化反应活性时，在免疫染色前用1%硫酸锌水溶液加以处理能够得到完全恢复。
经实验结果证实，组织切片在55~60℃温度下烤片，时间小于 16 小时，不会影响大多数抗原活性的保存。但免疫组化染色是一个复杂的过程，从用作免疫组化检测的组织块的制备到免疫染色的本身程序上均有可能引起抗原或多或少的丢失。因此，测试在所有的免疫组化染色过程中可能出现的影响免疫活性的原因都有必要。
