详解病毒示踪技术及其注射方法

详解病毒示踪技术及其注射方法

作者:RWD
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病毒载体概述

根据病毒载体使用目的可将病毒载体划分为两类:一种是广泛应用于科研的“基因表达载体”,另一种“基因治疗载体”则应用于临床居多。病毒载体具有保留病毒高效感染、转染能力以及去除或减少病毒病理功能基因的特征。现在被使用的病毒载体被称为“重组病毒载体”。


重组病毒载体包含三大特征:
去除大多数病毒功能的基因
保留病毒颗粒包装序列

外源基因和外源基因辅助序列


重组病毒载体包含三大特征


重组病毒构建的模式首先应保证:组装与复制序列不在同一个质粒上,并且最终组装病毒所包裹的基因组序列只含表达的外源基因以及外源基因的辅助片段,不可包含控制病毒复制的序列。如果包装出来的新一代病毒,仍然具有复制序列,那么它的生物安全性会存在巨大的隐患。因此“重组病毒”又可称为 “复制功能缺陷重组病毒”。

病毒载体直接注入中枢神经系统及其表达分析

目前,病毒载体在实验室神经科学活体研究中,通常是应用病毒直接注射的方式注射到目标脑区,然后再进行后续研究。病毒表达的鉴定包括:鉴定基因表达、鉴定蛋白表达和鉴定神经元亚型,具体参考下图所示。


鉴定基因表达、鉴定蛋白表达和鉴定神经元亚型


病毒载体在中枢神经系统中的传递模式

根据我们注射方式的不同,病毒病毒载体在中枢神经系统中的传递模式和表达方式也不尽相同。使用立体定位仪注射模式大多数会产生垂直的孔,注射理想状态是产生球型扩散,实际情况由于操作精度及针头停留时间的一个情况影响最后扩散的模式往往是沿着注射孔径分布。轴突注射模式主要沿轴突传递。脑室/脊髓注射模式则沿腔壁分布。血管注射模式会沿血管网分布。


血管注射模式会沿血管网分布


实验室常用的病毒载体

常用的病毒载体分类为:CMV质粒、EBV质粒。逆转录病毒载体为:疱疹病毒 、腺病毒、腺相关病毒、狂犬病毒。关于病毒载体的优劣势如下图所见:

Lentivirus(慢病毒)中编码为RNA,装载序列容量小于8KB,产生的免疫反应较低。

AAV(腺相关病毒)的劣势在于装载容量偏小只有4.5KB,它的优势在于免疫反应非常低,利于动物后期的快速恢复及后续的神经科学研究

Adenovirus(腺病毒)优点是装载容量很大,缺点是造成免疫反应很强。


关于病毒载体的优劣势


病毒载体的具体分析

慢病毒(Lentivirus)

慢病毒是一种逆转入病毒,它是RNA逆转为双链DNA整合到宿主细胞基因组。质粒来源广泛,主要来源于免疫缺陷病毒,比较常用的有HIV-1。慢病毒(Lentivirus)具有的一大特点是广泛细胞感染能力,无论是神经元、胶质细胞、还是神经干细胞均可感染,在Lentivirus包装过程中它的膜蛋白VSV-G必须要放在包装质粒当中,出于对Lentivirus生物安全性的考虑,我们把真正转入的目标外源基因的序列包装在转染质粒上。具体可参考下图:


把真正转入的目标外源基因的序列包装在转染质粒上

把真正转入的目标外源基因的序列包装在转染质粒上


腺病毒(Adenovirus)

腺病毒基因组的容量特别大(36KB),是DNA类型病毒。在DNA序列当中,目前通常将E1替换为外源基因,由于E1基因对于腺病毒的生命周期是很重要的,替换掉后只能把改造后的腺病毒基因导入到稳定表达E1蛋白中HEK293细胞中包装。包装完成所产生的病毒溶液会导致一定程度的炎症反应,容易对神经元造成水肿,对后续的行为学研究、形态学研究产生很大的影响,应用神级科学手术存在比较明显的缺陷,因此不适合作为基因治疗载体。


腺病毒基因组的容量特别大(36KB),是DNA类型病毒


腺相关病毒(Adeno-Associated Virus)

腺相关病毒是48KB单链的DNA,基因组包括Rep编码的AAV生命周期相关蛋白 、Cap编码的AAV衣壳蛋白两个开放阅读框,另外需要helper plasmid编码AAV复制相关蛋白,待三个质粒全部转染进入HEK293细胞后,便可包装成为具有感染能力,但无复制能力的AAV病毒颗粒。


腺相关病毒


重组腺相关病毒(recombinant AAV,rAAV)

重组腺相关病毒是目前已发现的结构简单的一类单链DNA复制缺陷型病毒,具有安全性高、免疫原性低、宿主细胞范围广和在体内表达时间长等特点。科学界现普遍认为AAV不会导致人类疾病,是目前最有前景的基因治疗载体。基因工程化的AAV能转导外源基因,借助特定启动子、光遗传学/化学遗传学元件、钙指示剂、神经递质探针或Cre/lox P,Flp/FRT重组酶技术,可选择性地标记特定的神经元。可根据感染对象细胞有针对选择不同AAV的血清型,越来越多的神经环路研究使用AAV作为神经示踪工具。


重组腺相关病毒


狂犬病毒Rabies Virus

狂犬病毒不同于其它病毒载体,不可以作为广普的病毒载体感染各类细胞。作为神经科学研究的工具,狂犬病毒被应用的点在于其神经专嗜性(neurotropic viruses)。野生型狂犬病毒细胞内高拷贝数具有细胞病毒,可逆行多级神经元影响环路研究分析。产生移除糖蛋白G,重组SAD△G-GFP狂犬病毒不能逆行感染神经元。后来通过产生引入外源膜蛋白EnVA重组EnVA-SAD△G-GFP特异感染表达受体TVA的细胞进行感染。


狂犬病毒Rabies Virus


病毒的注射与表达

1、准备工具

瑞沃德71000全自动脑立体定位仪、R480玻璃微电极注射泵及MP-500微电极拉制仪拉制出的电极来共同使用:

2、病毒注射流程

将小鼠诱导麻醉后套好麻醉面罩,进行头部固定,在脑立体定位仪上切开头顶皮肤,清理颅骨表面。


在立体定位仪上切开头顶皮肤,清理颅骨表面


病毒注射前需将小鼠的头部调平,调整鼻夹和耳肝Z轴高度,使小鼠颅骨表面前后左右Z轴高度一致。


使小鼠颅骨表面前后左右Z轴高度一致。


根据目标脑区的立体定位图谱坐标进行调整,用颅骨钻钻开小鼠颅骨,用针尖挑破硬脑膜。

瑞沃德R480玻璃微电极注射泵配备独特的垫圈设计,保证柱塞和玻璃毛细管之间紧密结合,确保注射高精度和高气密性,玻璃电极代替注射器注射允许超显微注射和更小的组织损伤。适用于动物颅脑病毒、示踪剂等立体定位注射,或者配套显微操纵仪对斑马鱼、爪蟾卵母细胞、胚胎、以及昆虫幼体等进行超精细的纳升级显微注射。

超高精度、运行稳定

注射精度高达1%,最小注射体积分辨率0.1nL,保证高精准注射量。
采用独特密封材质,保证注射过程不会出现漏液或者气泡。
反复测试上万次注射精度不变,重复性佳,运行稳定。

智能设定,轻松操作

智慧触控界面,简洁直观显示参数设置及注射进程等。


智慧触控界面,简洁直观显示参数设置及注射进程等。


掉电保护设计,断电重连可继续执行未完程序。


掉电保护设计,断电重连可继续执行未完程序。


新增留针时间设定功能,注射完成后如需留针操作,不再需要计时器。

便捷易用,省心省力

注射次数自动计数,省去注射多个细胞人工计数的繁琐。
常用程序设置参数可保存,方便调用,提高工作效率。
设置循环注射操作,对同一样品多次间隔注射提供便利。

注射/抽吸过程,可以实时观察当前状态。


注射/抽吸过程,可以实时观察当前状态


玻璃微电极的尖端插入到目标脑区的坐标深度,注射完毕后电极停留10min,缝合伤口并将动物放回笼内。
新一代的示踪方法——病毒载体具有突出优势。病毒载体采用改造后的病毒,安全性高、毒性低、能转入目的基因且选择范围广。依据其特性可供研究者自由组合使用。科学家们一直努力研究改造病毒,以期获得毒性更低,感染、传播、跨突触机制更加明确的神经示踪工具病毒,为脑科学研究提供更强大的工具。

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