如何提高脊髓组织冰冻切片质量?

如何提高脊髓组织冰冻切片质量?

作者:RWD
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取材

常见大小鼠的脊髓取材方法有两种。

“剪裁”法是沿脊髓冠状面将两侧椎板剪断暴露整条脊髓后将其夹持取出;“冲注”法是将注射器插入脊柱椎管尾端,通过快速推动注射器,使脊髓在PBS水流压力下吹出椎管。

“剪裁”法可能会出现因器械触碰产生压迫损伤和污染,而且大鼠椎板厚较难剪断,但便于取出整条脊髓。

当需要取胸段以下脊髓,选用“冲注”法更加省时且取出的脊髓结构更加完整,但要注意脊髓由尾椎向胸椎吹出时可能会被被膜缠绕而破坏原有形态。

当需要取颈段脊髓时,由于颈段椎管较窄且脊髓整体较长时,“冲注”法可能会由于水压不够无法冲出。

因此,实际取材过程中可根据脊髓目标节段进行取材方式的选择。


如何提高脊髓组织冰冻切片质量?


当同时需要取脊髓和背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)时,应先取出脊髓再取背根神经节,以防取背根神经节时牵拉破坏脊髓完整性。

由于DRG胞体位于椎间孔中,从椎间孔中夹取DRG时应小心,勿损伤胞体。部分大鼠DRG脊髓远端神经纤维较为粗壮,可用止血钳夹住肌肉中暴露的神经纤维,将DRG胞体一起抽出。取出的DRG可以保留2-3 mm的神经纤维,方便后续实验夹取,避免夹持损伤胞体结构。

必须在取材时保证脊髓和DRG的完整性,后续才能切除完整无裂隙的组织切片。

固定

1. 一般选择4%的多聚甲醛在4℃下进行固定,多聚甲醛的质量分数越大,固定时间越久,对组织的固定收缩作用越强,对组织的损伤越大。

2. 随着脊髓组织固定时间的延长,其抗原表达下降,尤其是脊髓前角。

3. 若取材时PFA灌注不完全,可将取出的脊髓组织浸泡在PFA中4-6小时,但勿超过24小时,否则容易产生结晶,破坏后续染色效果。

4. 为保证固定质量,固定液的量应该保证充足。

脱水

脊髓组织是含水量较大的生物组织,为了防止冰冻切片过程中产生冰晶破坏组织结构,通常会使用蔗糖进行梯度脱水,常用15%、20%、30%的蔗糖进行脱水。

使用梯度蔗糖脱水的过程又称为沉糖,这是因为一开始将脊髓放入蔗糖中,脊髓通常会漂浮在蔗糖上层,随着时间的推移,高浓度的蔗糖会将脊髓中的水分析出,脊髓浮力降低最终沉至试管底。因此当脊髓沉底时,便可更换更高浓度蔗糖进行下一步脱水。

包埋

包埋前将脊髓和DRG从蔗糖溶液中取出,用吸水纸吸干表面残留水分。

冰冻切片通常都采用OCT(一种聚乙二醇和聚丙烯酸甲酯的混合水溶液)对组织进行包埋。包埋可直接在样品托上放置组织样品然后滴加包埋剂,也可以使用包埋盒底膜对组织进行包埋。

对于实验新人,选择合适尺寸的包埋盒底膜可以有效控制包埋剂的用量。对于小鼠脊髓和DRG推荐使用7 x 7 x 5 mm的包埋盒底膜,对于大鼠脊髓和DRG推荐使用17 x 17 x 5  mm的包埋盒底膜,对于更大动物的脊髓和DRG可选用更大尺寸的包埋盒底膜。

包埋DRG时,可以先在包埋盒底膜铺一层包埋剂,待包埋剂快冻实前,将DRG有序地摆放在包埋剂之上,然后再在上层铺满包埋剂。这样能够使切片时多个DRG胞体处于同一平面,避免后续切下的一张片子上仅有1、2个胞体,而不利于后保持染色条件的一致和数据统计。

为了减少脊髓和DRG组织在速冻过程中冰晶的产生,可以采用干冰、液氮等耗材对包埋的样品进行速冻,也可以使用具有速冻功能的冰冻切片机对其进行速冻。

瑞沃德冰冻切片机速冻台平均温度-42℃,同时还有装配帕尔贴的两个快冷点,开启速冻功能后2个快冷点在2分钟内可降温至-60℃。近80℃的温差,可以使组织快速跨越冰冻点,有效减少组织中的冰晶产生。

切片

脊髓和DRG组织的最佳切片温度为-15~-18℃,使用双制冷冰冻切片机时,样品头制冷能够更好保证组织样本处于最佳切片温度,达到最佳切片效果。由于环境温度不同、切片机品牌的不同,实际的最佳切片温度会有所差异。

脊髓和DRG组织的最佳切片厚度因实验动物和后续染色实验的不同而异。一般大小鼠脊髓切片厚度范围10-30 μm,DRG的厚度为8-20 μm。实验中具体的切片厚度推荐参考优秀期刊论文中厚度。

切片时若发现切片卷曲严重,可裁去组织周围空白包埋剂的,同时减少包埋剂也能减少贴片皱褶。

贴片与漂片

对于脊髓和DRG组织这类较小的组织,贴片时不易产生气泡或皱褶,可用室温玻片直接粘附冰冻切片。贴片易于保持脊髓组织的完整性,后续染色洗涤简便,但染色效率较低。DRG组织由于体积小,只能选用贴片的方式。

除了贴片外,脊髓组织还可以采用漂片的方式收集切片样本。使用漂片法时,用镊子夹取脊髓冰冻切片直接放入PBS溶液中即可。对于免疫组组化和免疫荧光来说,漂片法染色效率更高,出结果相对容易,但抗体消耗量大,且在后续染色实验过程中容易出现组织破碎,裱片困难,对操作人员的熟练度要求较高。


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