构建DIO小鼠模型:瑞沃德切片机在脂肪组织研究中的价值

构建DIO小鼠模型:瑞沃德切片机在脂肪组织研究中的价值

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前言

DIO(Diet Induced Obesity)小鼠模型是通过喂食高脂饲料诱导的肥胖模型,广泛应用于肥胖、二型糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢性疾病的研究。DIO模型饲料通常包含较高的脂肪比例,以模拟西方人群的高脂饮食习惯。主要包括60 kcal%脂肪(超高脂)和45 kcal%脂肪(高脂)等多种配方,以及10 kcal%脂肪的对照饲料。这些饲料通常使用猪油为主要脂肪来源,因其含有较高比例的不饱和脂肪酸,有助于模拟较为健康的饮食环境。

DIO模型已被广泛应用于药物的药效学评价,特别是针对肥胖和相关代谢性疾病的药物。通过在DIO模型上进行的药物治疗,可以观察药物对肥胖小鼠体重、血糖、胰岛素抵抗等指标的影响,从而评估药物的安全性和有效性。例如,GLP-1R激动剂在DIO模型中的应用,可以显著降低血糖和体重,改善肥胖症状。

DIO模型的建立涉及到复杂的遗传调控网络,其中包括脂肪组织的脂肪生成、脂肪分解、胰岛素敏感性等多个方面的基因表达调控。例如,SF1(类固醇生成因子-1)在DIO小鼠中的表达模式和功能研究,揭示了其在维持正常糖代谢中的重要性,并可能成为治疗肥胖及相关代谢疾病的新靶点。

材料

1、实验动物

C57BL/6J小鼠是最常用的品系,因为它对高脂饲料极为敏感,容易形成肥胖模型。造模可用8周龄左右雄性小鼠。

2、造模方法

(1) 高脂饲料配方:60 kcal%脂肪(超高脂)和45 kcal%脂肪(高脂)等多种配方,以及10kcal%脂肪的对照饲料;通常6-8周可建立肥胖模型及二型糖尿病模型,12周左右建立脂肪肝模型。

(2) 饲喂方式:自由进食进水;饲喂前期使用普通饲料搭配高脂饲料进行饲喂,慢慢过渡到完全饲喂高脂饲料;饲料需在低温环境下保存,小鼠饲料每2-3日进行更换防止其变质。

(3) 小鼠饲养环境:3只1笼饲养;但多只合笼饲养容易打架,导致小鼠体重下降甚至死亡,必要时可对其进行单笼饲养;使用木屑垫料防止小鼠吃玉米芯垫料。

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模型评估

1、体重

持续关注小鼠体重变化,造模期间体重呈上升趋势;造模组体重超过对照组20%为造模成功。

2、摄食量

测量摄食量,评估小鼠高脂饲料食用量。

3、体脂率

通过定期称重和使用如DEXA(双能X射线吸收法)或其他生物电阻抗分析设备测量体脂率,可以直观反映出动物模型的肥胖程度。

4、血糖

使用血糖仪检测小鼠血糖。小鼠的血糖值范围一般在80-120 mg/dl之间,血糖浓度超过120 mg/dl为高血糖,浓度低于80 mg/dl为低血糖。

5、血生化

血脂水平,包括总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)等,可以通过生化分析方法,如酶联免疫吸附测定(ELISA)或自动化生化分析仪来进行定量检测。

6、行为学

肥胖动物可能会出现的行为学变化包括进食行为和运动行为的改变。这些变化可以通过观察和特定的行为学实验来评估。

7、组织形态

组织形态学观察主要是通过显微镜观察肥胖动物模型中脂肪组织的病理变化,比如脂肪细胞大小、数量以及脂肪组织的分布情况,从而评估肥胖模型的成功与否。

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瑞沃德切片机在脂肪组织切片中的应用

脂肪组织因其独特的结构和丰富的油脂成分,使得在制作标本时相较于其他类型的组织面临更多挑战,尤其在进行冷冻切片的过程中,这些特性进一步增加了操作的难度。

脂肪组织石蜡切片的制备方法

(1) 固定:选择适当的固定时间和温度,以确保组织结构的完整性。

(2) 脱水与透明:控制好酒精和透明剂的处理时间,避免过度脱水导致的组织损伤。

(3) 包埋与切片:选择合适的石蜡种类和熔点,保证切片的连续性和完整性。

(4) 染色:染色剂的选择和染色时间的控制对结果影响很大,需要根据实际情况进行优化。

(5) 脱蜡与封片:脱蜡要彻底,封片时要确保切片平整、无气泡。

脂肪组织冰冻切片的制备方法

(1) 取材:获取新鲜的脂肪组织样本。

(2) 包埋及速冻:将脂肪组织放置于样品托上,使用OCT进行包埋,一般组织最大面为包埋面;开启快冷模式,2min后将样品托放置于快冷点上进行速冻,观察到包埋剂三分之二凝固后可使用冷锤从组织上部进行冷却,加快速冻时间。

(3) 切片:使用瑞沃德FS800系列冷冻切片机进行脂肪组织切片时样本头温度设置为-30℃至-35℃,箱体温度设置为-20℃左右。

(4) 贴片及染色:切好的组织薄片使用玻片贴片后进行染色。

TIPS

瑞沃德FS800系列冷冻切片机脂肪组织切片优点

半导体快冷点,温度可将至-60℃,30s组织快速冷冻,保障制片效果;

PID温控系统,全开窗切片温度变化不超过2℃,温控更精准,切片操作更便捷。

脂肪组织的染色

在脂肪组织染色的常用手段中,油红O染色和苏丹系列染色是两种重要的技术。油红O作为脂溶性染料,能在脂肪细胞中迅速溶解并与其中的中性脂肪紧密结合,从而实现对脂肪的特异性染色。而苏丹Ⅲ和苏丹Ⅳ作为另一种常用的脂肪染色试剂,它们能够将细胞内的脂质呈现为鲜明的红色或橘黄色,便于在显微镜下进行观察和分析。

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图2. 使用FS800切片后脂肪组织的显微

参考文献:

【1】Ji, Y., Park, S., Chung, Y., Kim, B., Park, H., Huang, E., Jeong, D., Jung, H. Y., Kim, B., Hyun, C. K., & Holzapfel, W. H. (2019). Amelioration of obesity-related biomarkers by Lactobacillus sakei CJLS03 in a high-fat diet-induced obese murine model. Scientific reports, 9(1), 6821. https://doi.org/10.1038/s41598-019-43092-y
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