小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养注意事项
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养注意事项
巨噬细胞RAW 264.7是一种小鼠巨噬细胞系，最初由美国国立癌症研究所(NCI)在1970年代分离，取材于Abelson小鼠白血病病毒诱发的肿瘤组织。其形态呈圆形或梭形（梭形属于极化状态），属于贴壁细胞，特定条件下会表现生长出伪足。由于具有胞饮和吞噬作用等特点，因此成为科研领域最常用的炎症细胞模型之一，常见应用包括免疫反应研究、炎症和感染性疾病研究、药物筛选和毒性评估等。
细胞形态
在形态上，其呈现圆形或梭形（梭形属于极化状态），属于贴壁细胞，特定条件下会表现生长出伪足。正常培养时为圆形或椭圆形，最好的状态是小而透亮。有时细胞松散附着、堆积并变圆是正常，但长出伪足呈梭形（一般是极化）超过10%时需谨慎。
培养条件
DMEM+10%FBS+1%PS（推荐培养基为1640和高糖培养基及高质量血清培养）。
95%空气+5%二氧化碳；37℃。
RAW264.7巨噬细胞培养难点
刚开始培养时，多数人总会出现问题，例如细胞分化（最常见）、长伪足、不易消化、生长缓慢、漂浮不贴壁等问题。
实验方法
1、实验材料
细胞系：小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7
试剂：高糖培养基、PBS、无血清细胞冻存液
2、实验方法
细胞复苏
将含有1 mL RAW264.7细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速（一般是1min）摇晃解冻（注意不要把瓶口浸入水浴锅避免污染），加4 mL培养基(提前预热)混合均匀。随后在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后轻轻吹打混匀并将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶过夜（刚开始培养推荐用T25培养瓶，状态好再转移到大皿）。
Tips：
1、RAW264.7细胞比较容易极化，所以在刚开始复苏时尽量把培养基预热，避免极化。
2、根据细胞状态第二天再选择是否换液，频繁换液会影响生成。
3、推荐用T25瓶培养，RAW264.7细胞喜欢高密度生长，细胞密度过低会生长很慢。
细胞传代
推荐细胞长到80%-90%密度时传代，细胞密度低会长得很慢且容易极化，传代时弃去培养上清，状态不好时可用1 mL培养基润洗RAW264.7细胞1次。随后加2 mL培养基于培养瓶中，使培养基浸润所有细胞，然后轻轻吹下细胞，将吹下来的细胞及细胞悬液收集到无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加2-3 mL培养液后吹匀（镜下观察为密集且明亮圆形小细胞）。按1:2/1:3比例分到新的培养瓶中，摇匀镜下观察（注意摇匀不然会叠起来生长）。
Tips：
1、RAW264.7细胞比较容易极化，所以不推荐传代时用胰酶消化和PBS吹打。
2、RAW264.7细胞有时候无法避免极化，所以只需要控制好一定的计划比例就好，如果极化比例较高，可以用培养基轻轻吹下（极化之后会贴壁，不容易吹下），更换培养皿。
3、细胞密度过高时，RAW264.7细胞容易发生自发极化。故需要密切关注细胞的汇合程度，及时进行传代，避免细胞叠加成层后再进行传代，以保持最佳的细胞生长状态。
4、如果正常培养时RAW264.7细胞已经大面积呈现出梭形、伪足时，不建议使用以免导致数据异常。
5、极化后RAW264.7细胞会很贴壁，所以传代时无需过于用力吹下细胞，避免误伤正常细胞。
细胞冻存
先加入1mL培养基轻轻混匀把状态不好细胞吸出弃用，随后用PBS吹打收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心45min，弃去上清液，用再PBS清洗一遍，弃尽PBS，然后进行细胞计数。根据细胞数量(推荐细胞密度5×106~1×107/mL)加入无血清细胞冻存液，轻轻吹打混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意标识代数、日期。随后放入-80℃冰箱。（比较豪的课题组为了减少批次差异会选择一次大量培养并冻存）
3、其他常见问题
培养时RAW264.7很多/部分极化了能继续培养吗？
如果巨噬细胞极化比例较高，建议弃置重新复苏，但是少量RAW264.7细胞出现分化现象是正常的。这种情况通常不会对实验结果产生显著影响。
1640培养时觉得生长很慢或容易极化？
可以尝试较高的葡萄糖浓度的培养基可能更容易生长（根据实验谨慎选择），还可以增加FPS浓度或更换高质量血清，如果仍未解决考虑是细胞污染（比如支原体）。
传代后部分细胞长时间不贴壁？
细胞长时间不贴壁时，离心重悬放进新鲜的培养基培养，注意要吹打均匀，抱团不利于贴壁。
传代或者换液的时间？
一般1-2天传代，一定不要超过3天，否则可能长太满死亡或者极化。
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