Western Blot实验中十大常见问题
Western Blot实验是生命科学研究的经典技术，但很多科研人员在实验过程中常常遇到各种问题，如条带模糊、背景过高、信号消失……等问题，导致结果不理想。
本文将详细分析Western Blot实验中十大常见问题，并提供实用的解决方案，助您轻松跨越实验难关，让WB结果从此清晰又漂亮！
问题1：无背景无条带（白片）
可能原因
最可能是一抗失效，或者二抗种属出错，比如兔（Rb）加成大鼠（Ra）
解决方案
1. 检查样本膜是否在成像范围内
2. 目的蛋白完全没有信号，但同时做的内参是正常的，那么大部分情况是一抗抗体失效或者用错二抗,可以重新孵育抗体
3. 目的蛋白完全没有信号，内参也没有信号，则考虑发光液是否失效。如果膜上没有marker，则为转膜失败。需重新配制发光液，如果还没有条带，只能重新进行实验
4.如果中间出现了细微的条带，可能是蛋白上样量太少，或一抗浓度过低
问题2：高背景（均一弥漫性）
可能原因
封闭不充分，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够
解决方案
1. 降低一抗浓度，1/5000或1/10000使用抗体
2. 增加洗膜时间和次数（ 5min*5次或者10min*3次）
3. 如不能解决，可重新封闭
问题3：出现非均一性背景
可能原因
实验过程中PVDF膜或NC膜未一直保持湿润
电泳或转膜过程中温度过高
解决方案
1. 在实验过程中注意使用的膜蛋白面不要风干
2. 电泳和转膜过程中不要使用过高的电压，会导致实验温度过高
3. 夹取膜时，尽量用镊子夹取Marker所在位置，以防刮伤刮坏蛋白样
问题4：出现黑点和黑斑
可能原因
封闭液未完全溶解，产生不溶性颗粒
解决方案
1. 配制封闭液时，充分摇匀溶解脱脂奶粉
2. 封闭结束之后PBST清洗1-3遍
问题5：非特异性条带
可能原因
一抗非特异性与蛋白结合，多克隆抗体易发生
解决方案
1. 延长封闭时间
2. 更换一抗或降低一抗浓度
问题6：条带中出现边缘规则的白圈
可能原因
PAGE胶中有气泡，转膜过程中膜与胶之间存在气泡
解决方案
1. 配制凝胶时，可以使用注射器缓慢匀速加入下层胶
2. 转膜前去掉膜和胶之间的气泡，在缓冲液液面下进行三明治组装
3. 可使用滚轴赶气泡
问题7：条带中间出现白色（反白）
可能原因
中心部位高浓度酶把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了
解决方案
1. 快速曝光，在中间部位底物消耗之前拍照成功
2. 降低蛋白量，降低一抗二抗浓度
问题8：条带拖尾
可能原因
蛋白量太大或轻微降解，一抗浓度过高或时间太长
解决方案
1. 调整蛋白量
2. 一抗浓度和时间也可以降低
问题9：条带呈哑铃状
可能原因
配制胶凝固不均一，样本有杂质
解决方案
1. 等PAGE胶完全凝固再拔梳子
2. 样本使用前先离心，避免杂质沉积在中间
问题10：条带变形
可能原因
SDS-PAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒
解决方案
1. 配胶过程中要小心，使用无杂质的液体
2. 更换配胶用的海绵垫
3. 倒胶时使用胶头滴管或注射器加胶，如产生气泡可用注射器吸出
实用工具推荐
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1超高灵敏度，可用于pg级样本，弱信号成像更清晰
2超快速成像，多数样本1秒完成成像
3成像范围更广，强信号和弱信号条带可同时显影
4体积小巧，节省实验室空间
5大于150平方厘米感光芯片接触式成像，无信号损失
6智能软件，自带采集和分析功能，蛋白条带灰度值直接可见
Western Blot实验中的常见问题大多可以通过优化实验条件和操作技巧来解决。
如果您在实验中遇到其他问题，欢迎留言咨询，我们将为您提供专业解答！
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