做光纤记录实验采不到荧光信号？注意事项在这里
光纤记录实验操作较为简便，能够长时间稳定的动态检测动物的神经信号，目前在神经科学研究中应用越发广泛。但是在做光纤记录实验中，有时会遇到采集不到荧光信号的情况，各位小伙伴是否也曾遇到过？今天，小沃带大家梳理一遍采集不到信号的可能原因及实验注意事项，助你实验更顺畅！
01 病毒
1.病毒是否存在反复冻融现象，反复冻融会降低病毒滴度，从而影响病毒转染效率。因此光纤记录实验中，病毒应即拿即用，避免冻融。
2.病毒与目标脑区神经元特异性结合程度也会影响荧光信号。
02 病毒注射
1.手术前定位：通过预实验对脑区精准定位（可通过台盼蓝注射定位）。在病毒注射前，我们可以先注射台盼蓝进行预实验以达到练手的目的，提高后面实验的成功率。
脑区坐标定位参考：调平时注意左右高度差小于0.03mm。
2.病毒注射：选择较细直径的玻璃电极可以减少注射损伤，对于浅层脑区注射，可减少病毒泄露。病毒注射后留针10min。
3.病毒注射检测：切脑片看荧光表达。
荧光染色实验拍不出带有荧光的细胞，可能原因是显微镜聚焦未在神经细胞这一层上（如上图出现模糊团状，可能会是细胞）、注射的脑区与病毒反应的特异性神经元数量太少、或是荧光淬灭掉了。
注意事项：
如果病毒没注射成功，可能原因有手术中脑区定位有偏差导致病毒注射位置不对（目标脑区很小的话会常存在这个问题）、病毒注射后顺着脑室流走、病毒注射后未留针导致病毒顺着注射孔被析出。
03 陶瓷插针埋植位置
1.病毒注射与陶瓷插针植入可以在同一个手术进行，避免二次手术对小鼠造成伤害；
2.选择合适的夹持器，满足不同深度及相对距离的植入手术；
3.定期查看定位仪操作臂与夹持器的固定情况，防止角度偏差。
病毒注射表达区域与陶瓷插针的植入位置需要保持接近，根据文献中数据，超过100µm就会明显影响信号强度。
HanQin et al., Neurophoton,2019
04 耗材参数搭配
1.光纤记录实验对环境光比较敏感，建议实验在光线相对稳定、昏暗的环境下进行。光纤记录更适合选择黑色陶瓷插针与黑色陶瓷套管，可避免环境光对荧光信号的影响；
2.较大数值孔径的耗材有助于荧光信号的传输，所有的配件耗材保持相同的芯径、NA数值更有助于实验记录；
3.使用高强度的激光器对光纤进行漂白，使得光纤等耗材的自发荧光降低，减少噪声干扰。
光纤漂白器
05 光纤记录参数设置
1.首先检查线路连接：包括光纤与机器连接的端口，光纤与小鼠连接的端口（并使用酒精擦拭光纤端口和镜头）。
2.调高曝光时间：Cmos相机拍摄时间增加，有助于采集到荧光信号。
注意事项：
1.若未记录到信号，可适当调高光源功率；
2.动物脑区较大，病毒注射量可适量增加；
3.病毒注射后也可先不埋植插针，待2-3周后病毒表达，陶瓷插针连接光纤一起植入，边植入插针边检测钙信号。
