做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里

做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里

作者:RWD
浏览量:3120

光纤记录实验操作较为简便,能够长时间稳定的动态检测动物的神经信号,目前在神经科学研究中应用越发广泛。但是在做光纤记录实验中,有时会遇到采集不到荧光信号的情况,各位小伙伴是否也曾遇到过?今天,小沃带大家梳理一遍采集不到信号的可能原因及实验注意事项,助你实验更顺畅!


01 病毒


1.病毒是否存在反复冻融现象,反复冻融会降低病毒滴度,从而影响病毒转染效率。因此光纤记录实验中,病毒应即拿即用,避免冻融。


2.病毒与目标脑区神经元特异性结合程度也会影响荧光信号。


02 病毒注射


1.手术前定位:通过预实验对脑区精准定位(可通过台盼蓝注射定位)。在病毒注射前,我们可以先注射台盼蓝进行预实验以达到练手的目的,提高后面实验的成功率。


脑区坐标定位参考:调平时注意左右高度差小于0.03mm。


做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里


2.病毒注射:选择较细直径的玻璃电极可以减少注射损伤,对于浅层脑区注射,可减少病毒泄露。病毒注射后留针10min。


做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里


3.病毒注射检测:切脑片看荧光表达。
荧光染色实验拍不出带有荧光的细胞,可能原因是显微镜聚焦未在神经细胞这一层上(如上图出现模糊团状,可能会是细胞)、注射的脑区与病毒反应的特异性神经元数量太少、或是荧光淬灭掉了。


做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里


注意事项:
如果病毒没注射成功,可能原因有手术中脑区定位有偏差导致病毒注射位置不对(目标脑区很小的话会常存在这个问题)、病毒注射后顺着脑室流走、病毒注射后未留针导致病毒顺着注射孔被析出。


03 陶瓷插针埋植位置


1.病毒注射与陶瓷插针植入可以在同一个手术进行,避免二次手术对小鼠造成伤害;


2.选择合适的夹持器,满足不同深度及相对距离的植入手术;


3.定期查看定位仪操作臂与夹持器的固定情况,防止角度偏差。


病毒注射表达区域与陶瓷插针的植入位置需要保持接近,根据文献中数据,超过100µm就会明显影响信号强度。

做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里

HanQin et al., Neurophoton,2019


04 耗材参数搭配


1.光纤记录实验对环境光比较敏感,建议实验在光线相对稳定、昏暗的环境下进行。光纤记录更适合选择黑色陶瓷插针与黑色陶瓷套管,可避免环境光对荧光信号的影响;


2.较大数值孔径的耗材有助于荧光信号的传输,所有的配件耗材保持相同的芯径、NA数值更有助于实验记录;


做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里


3.使用高强度的激光器对光纤进行漂白,使得光纤等耗材的自发荧光降低,减少噪声干扰。


做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里

光纤漂白器


05 光纤记录参数设置


1.首先检查线路连接:包括光纤与机器连接的端口,光纤与小鼠连接的端口(并使用酒精擦拭光纤端口和镜头)。


做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里


2.调高曝光时间:Cmos相机拍摄时间增加,有助于采集到荧光信号。


做光纤记录实验采不到荧光信号?注意事项在这里


注意事项:
1.若未记录到信号,可适当调高光源功率;


2.动物脑区较大,病毒注射量可适量增加;


3.病毒注射后也可先不埋植插针,待2-3周后病毒表达,陶瓷插针连接光纤一起植入,边植入插针边检测钙信号。

收藏 点赞(0)
分享
评论列表共有 0 条评论
暂无评论
在生命科学、动物健康和临床医疗领域提供可信赖的解决方案和服务,全力帮助客户取得成功