脑缺血模型构建及检测,助你快速掌握要领!

脑缺血模型构建及检测,助你快速掌握要领!

作者:RWD
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实验方法实战教程


实验动物该怎么选择?

不同脑缺血模型,弄不清对应构建方法?

常用的血流监测技术,你都掌握了吗?

「全线赋能·“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第五期为大家聚焦

《脑缺血模型构建及检测》

从实验动物的选择、不同模型的分类

各个模型的构建方法到血流监测技术

两位老师将进行综合详细的讲解

全面助力你的科研实验研究


直播时间

6月21日(周二)19:00


报名方式

实验方法实战教程

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主题:脑缺血模型构建


脑缺血研究背景

脑缺血动物模型构建

脑缺血模型构建实验仪器


讲师:孙绍强

讲师:孙绍强


瑞沃德行业解决方案专家,在膜片钳/钙成像/干细胞诱导及治疗上有着丰富的实验经验,曾参与多项重大研发及自然科学基金项目,曾在Cell Stem Cell 上发表论文,专注于神经疾病,脑缺血及神经退行性疾病模型制备和机制研究,已为上百家客户提供专业的神经疾病整体解决方案。



主题:脑卒中研究中的血流监测技术


激光多普勒

激光散斑

超声多普勒

核磁共振成像

双光子显微镜


讲师:殷维君

讲师:殷维君


瑞沃德微循环监测解决方案专家,在生理信号监测和血流血氧成像领域拥有丰富的经验,主导动物活体成像解决方案的设计及优化,专注于临床及临床前微循环监测解决方案的构建。


上期直播间互动问题

这次我们全部为小伙伴解答↓


Q1:组织剪切的大小有没有具体要求,肿瘤组织一般2-4mm可以吗?

A1:这要根据组织类型去判断,一般会预处理成10mm左右的组织块,太大可能会导致处理不完全,太小可能导致细胞死亡增加,甚至导致样本变稠等。


Q2:细胞活率80%就可以了吗,看到一些资料写的都要90%以上。

A2:这个需要根据下游实验的需求灵活调整,如果样本存活率不能达到要求的话,除了优化实验条件以外,还可以通过一些死细胞去除的试剂来优化已获得的样本。


Q3:低温解离细胞与常规的37度制备单细胞优势分别是什么?区别是什么?

A3:37℃条件下进行组织解离,由于细胞转录活跃,因此解离过程中基因表达可能会发生改变,可能会干扰应激反应相关基因表达,所以在进行snRNA-seq时可以通过使用冷活性酶释放细胞核,同时一些热敏感或者脆弱的细胞更适合采用低温解离的分离方式,但是低温条件对一些质密难解离的组织的处理效率可能会降低。

另外,温度对不同细胞种类也有一定影响,比如在进行脑组织解离时,热解离可能会影响神经元和星形胶质细胞的获取,但是会大量富集小胶质细胞,所以在进行组织解离时,根据获得目的细胞的需求要灵活调整解离方案。


Q4:裂红处理有什么注意事项吗?

A4:如果直径6-8μm的细胞占比较高,且有核率偏低,这表明红细胞含量可能较多,需要进行红细胞裂解,如果红细胞裂解依然不干净,不建议增大裂解体系,建议适当延长裂红时间,或适当增加裂红次数。


Q5:流式染色时间及温度如何选择?

A5:染色本身取决于抗体抗原之间的结合能力,染色时间和温度,受限于抗体浓度,一般根据选择抗体的说明书推荐的浓度和孵育时间、温度选择。我的实践经验:当不清楚说明书的情况,我会选择室温染色12-15min(取决于抗体浓度微调),或4度冰上30min。注意染色时间尽量不要让细胞破损,否则死细胞碎片会影响流式结果。此外细胞消化完毕后应该尽快染色处理,特别是一些凋亡染色、胞内酶染色为保持细胞物质活性,应最好尽快染色。


Q6:请问流式细胞实验中单抗进行荧光需要什么样的对照?

A6:关于对照设置,这个比较复杂,一般我们最好是选择同型对照作为阴性对照组,得到的结果往往是比较好的。所谓的同型对照就是同种属同亚型、相同荧光标记物、使用剂量和浓度相同,且属于非特异性结合的抗体为同型对照组。通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。

还有一类就是最常见的纯阴性对照,检测细胞群不进行任何抗体处理,直接进行流式检测,这就是简单消除细胞和溶剂本身的影响,这种方法最大的好处是节约抗体,毕竟抗体很贵。


Q7:如何减少补偿的干扰?

A7:补偿干扰往往是多激光的流式仪器才会发生一定干扰情况,此时,可以根据抗体公司提供的染料搭配方案选择比较好,也就是发射光谱的波长峰尽量不重叠的染料,这样补偿干扰会尽量消除。因此,往往需要查看染料的波长范围,此外,对于4色以上的多色标记情况,一般不常见,此时往往染料的波长范围难以避免的重叠,这时候,推荐使用抗体公司推荐的配色方案,尽量避免发射光谱的重叠。此外很多流式仪器配套软件都带一定算法对补偿进行修正,可以适当修正这个影响。


Q8:细胞自发荧光如何解决?

A8:细胞自发荧光往往是细胞内物质带有荧光,植物细胞因为叶绿素原因会自带一定荧光,然后一些药物处理下,药物本身带有发色基团,也可能自荧光,此时,纯阴性对照的设置可以补偿一定的情况。然后就是染料的选择情况,染料荧光波长范围避免与细胞自发荧光的波长的重叠,这样会比较好一些。我之前做药物的细胞凋亡实验时候,考虑到药物的情况,就没有使用常见的凋亡检测的Annexin V染料,而改用Annexin V-APC 。最后说下,尽量设置纯阴性对照、有条件做下同型对照,往往可以在数据处理时候适当减少部分因素的影响。这样流式的结果会更好!


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