清醒动物大脑神经递质的提取和在线检测分析

清醒动物大脑神经递质的提取和在线检测分析

  微透析-高效液相-电化学（MD-HPLC-ECD）

1 微透析技术基本原理

微透析技术是一种在体微量化学采样与检测技术，由西班牙之Delgado 及瑞典之Ungerstedt 等人于1972年自更早的压抽导管（push-pull cannula）改进而来。 基本原理：选择具有一定截留分子量的纤维半透膜制成的探针埋入待测的组织区域，以恒定速度向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌流液，当灌流液流经探头前端透析膜时，组织内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜外扩散入膜内，并随灌流液被引流至探针外，按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中待测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞外生物活性物质浓度的经时变化过程。

2 微透析技术的特点和优势

★空间分辨性高，样品即取即测，可代表取样位点目标化合物的浓度；

★细胞外液采样，真实反映目标化合物的浓度水平；

★透析样品不需预处理，样品中不含蛋白质、酶等大分子物质，可直接测定；

★活体采样，维持机体的完整性，接近生理状态，减少实验动物数量；

★连续采样，可获得药物代谢中间过程的信息；

★同一生物个体，避免因体液量损失对药物分布及消除的影响；

★样品体积恒定，样品中各成分浓度基本不变，膜对药物的非特异性吸附少；

★损伤小，微创，可在清醒、自由活动的动物上连续取样，且动物本身自成空白对照。

3 微透析技术的应用（基础研究）

4 微透析技术的目标部位

5 微透析应用实际案例

1. 动物大脑

2. 肝、血液、皮肤

3. 胆汁

4. 眼部

6 动物大脑微透析实验

实验材料

1. 动物麻醉、脑区定位

主要包括

1-异氟烷（R510-22）

2-空气泵（R510-29）

3-小动物麻醉机（R540IE）

4-脑立体定位仪（68025）

5-定位仪专用麻醉/回收面罩（68666）

6-麻醉诱导盒（V101）

7-气体过滤罐（R510-31）

8-气体回收器（R546W）

2. 大脑手术和动物护理

3. 微透析-高效液相-电化学在线检测分析

1-微透析泵（ESP-64）

2-微量注射器（LTN 1002）

3-清醒活动装置（TSU-20）

4-清醒活动笼（BC-80）

5-微透析探针（C-I-X-Y）

6-管路（JT-10-100）

7-管路接头（JB-30）

8-在线自动进样器（EAS-20s）

9-HPLC-ECD一体式检测分析系统（HTEC-510）

10-工作站（EPC-710）

11-耗材（分离柱等）

操作步骤

1、动物准备

（1）动物麻醉与固定

（2）备皮

（3）暴露颅骨

（4）定位调节

（5）定位钻孔

2、植入探针导管

（1）植入螺丝

（2）植入导管

（3）牙科水泥固定

（4）伤口缝合

（5）动物恢复

3、开始透析和在线检测…….

（1）微透析-HPLC-ECD安装和测试

（2）微透析探针的准备

（3）灌流液的准备

（4）植入微透析探针

4、管路和探针的清洁和保养

（1）探针：透析结束后，应立即取出探针，用导管帽插入导管封闭。取出的探针置于双蒸水中，用双蒸水在1-2ul/min的速度下冲洗过夜（保持原管路的连接一起冲洗），充分排尽整个管路及探针中的盐分，然后取下探针，置于新鲜双蒸水中保持湿润状态，于4℃冰箱中保存（目的是防止探针膜收缩）。

（2）转环：在上述双蒸水过夜冲洗完成后，再用100%丙酮以1-2ul/min的速度冲洗约1个小时（切忌使用次氯酸冲洗），之后自然晾干，密封其出入口，置于低温条件保存，否则易长菌，导致后续微透析时回收率降低。

（3）管路：在第（1）步完成后，用次氯酸冲洗约0.5个小时，然后再用双蒸水冲洗约1个小时，清除残留的次氯酸，之后密封其出入口，置于低温条件保存，否则易长菌，导致后续微透析时回收率降低。

5、回收率的测定（体外）

在aCSF液中加入所要透析的目标物的标准物品（已知浓度），将探针置于此溶液中，在相同灌流速度（Ringer’s液）、相同外界温度的条件下进行透析，收集透析出来的样品，测定目标物的的浓度，从而可得此条件下该探针的相对回收率。

影响回收率的因素：

• 目标物的特性，如分子量大小、溶解性
• 微透析膜的特性，如材质、孔径、长度（0.5-10mm）
• 灌流速度，一般为0.5-5ul/min，一般在30-60min后开始收集
• 灌流液的化学成分、PH值等……

6、注意事项

微透析实验与许多实验不同，很多方面取决于操作者的技能水平，特别值得注意的有以下几点：

1、埋置探针的位置（AP、ML、DV值）要准确，选择合适的探针膜长，一般来说，在目标部位纵向跨度范围内，膜长选择越长，回收率越高；

2、探针操作时，需要特别细心，避免探针膜的损坏，从而延长探针的寿命和使用次数；

3、探针使用前的预处理，以及在使用间隔期间的处理、冲洗、浸泡，目的也是延长探针的寿命和使用次数；

4、连接管路时，需仔细检查，防止漏液和堵塞，同时也要防止连接管和接头的损坏。

7 MD-HPLC-ECD 在线检测分析应用举例

微透析-HPLC-ECD在线检测分析的优势：

• 动物麻醉和清醒状态取样；
• 定点连续取样；
• 适用于脑部、脊髓神经、血液、肌肉以及各种软组织取样等；
• 取样过程不破坏动物机体完整性；
• 可透析分析神经递质、单胺类物质、氨基酸和能量代谢物等；
• 可利用微透析进行缓解给药；
• 样品纯净度高，不含蛋白质等大分子物质；
• 极小的采样量即可进行定量检测；
• 检测精度高，可达到fmol、pg级别；
• 样品采集，检测过程可实现自动化。

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