Western Blot实验全攻略：轻松掌握蛋白质分析利器

Western Blot 实验全攻略

概括

Western blot 是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定蛋白质的存在及其相对分子量。

原理

Western blot 技术基于蛋白质的电泳迁移能力和抗原-抗体反应。首先，样品中的蛋白质通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离，然后将蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。之后，通过特异性抗体检测目标蛋白质。

应用

1、蛋白质表达分析：

检测特定蛋白质是否存在以及其相对丰度。

2、蛋白质相互作用研究：

通过共免疫沉淀（Co-IP）后进行 Western blot 分析来研究蛋白质间的相互作用。

3、蛋白质修饰检测：

使用特异性抗体检测特定的蛋白质修饰，如磷酸化、乙酰化等。

4、蛋白质亚型分析：

通过不同的抗体区分蛋白质的不同亚型。

优势

1、特异性：通过特异性抗体检测特定的蛋白质。

2、灵敏度：即使样品中蛋白质含量很低，也能通过放大信号来检测。

3、定量能力：通过标准化和对照样品，可以进行半定量分析。

局限性

1、样品处理：需要高质量的样品和适当的样品处理步骤。

2、抗体质量：抗体的选择和质量直接影响实验结果。

3、背景信号：非特异性结合可能导致较高的背景信号。

步骤操作

1、样品制备

在对细胞施以不同干预之前，一定要保证每孔之间的初始量是一样的，可以使用瑞沃德C100-Pro自动细胞计数仪对细胞进行计数后铺板。

2、蛋白样品准备好之后就可以进行电泳

首先将制备好的10%胶插入到电泳槽中（如左图），再将样本按照一定的量加入上样孔（如中图），开始电泳，80V，等样品跑过上层胶后转为120V，基本跑到右图的位置就可以结束电泳。

3、转膜

接下来需要将胶上的蛋白转移到PVDF膜上。提前准备好转膜液、甲醇（用来激活PVDF膜）、PVDF膜、转模夹、刮子。将电泳的板子稍微使用ddH2O清洗一下，去除电泳液后放入到转膜液中，三明治结构的夹子黑的一面放胶，白色一面放激活的PVDF膜，如下图。

最后将转模夹“黑对黑，白对红”放入转模槽中，千万别放反了，要不然辛苦两小时全白费，插头也要黑对黑，红对红！

我用的快转，所以一般42kD的分子就400 mA转25min就好了。

4、封闭

转膜结束后根据自己所需要的分子量选择裁膜或者保留全膜去进行封闭，市面上的封闭液或者5%BSA，5%脱脂牛奶都是可以哒！如果要裁膜，一定要注意不要让膜干掉，膜最好一直保持湿润状态。常温下摇床封闭一个小时（图7）。

5、孵育

封闭结束后就可以配置抗体，4℃过夜孵育一抗。一抗要根据说明书的wb配置比例来配，还要关注一抗是兔抗还是鼠抗，方便第二天使用相应种属的二抗进行结合；孵育过夜后TBST洗3遍，每遍5-10min，进行二抗孵育，注意二抗也是根据说明书的比例来配哦，常温二抗孵育一小时就可以最后进行曝光了。

6、成像与分析

孵育完之后可以使用免疫印迹成像仪进行成像分析，本次实验也有使用瑞沃德新产品qTouch免疫印迹成像仪。其通过高灵敏度的感光芯片以接触式成像的方式进行信号采集，能够无损采集 Western Blot 的化学信号，因此成像非常清晰。只需要将蛋白样品膜放置在仪器的感光芯片上，通过操作软件即可完成图像采集和灰度值分析，推荐大家试用~