双光子全息光遗传学技术在探索神经编码行为中的应用

用光控制神经活动具有很高的时间分辨率，并且很容易针对基因亚型。但是如果要控制一个亚型中的许多单个神经元，必须在空间上将光限制在仅选定的神经元上（或仅将视蛋白表达在这些神经元上）。实现这一目标需要两个关键要素：1）将光聚焦到散射组织中单个神经元的能力；2）同时或几乎同时照亮多个神经元的能力（彼此之间在几毫秒内）。多光子激发解决了第一个问题，而光全息技术解决了第二个问题。

多光子光遗传学，一种是利用近乎衍射极限的双光子对表达视蛋白的神经元胞体进行直接的“螺旋扫描”，来激活神经元动作电位发放。根据所使用视蛋白的动力学和效力及其表达水平，这种方法在某些情况下需要对目标神经元进行毫秒级的连续扫描，以驱动动作电位发放。另外一种是通过将激光束重新聚焦到一个与神经元胞体大小相当的点上，通过 “单次激发”方式同时激活胞体和近端树突上的视蛋白分子，这样可以避免扫描。螺旋扫描也需要较低的能量，因此它能够在有限的激光照射下激活更多的神经元，但可能会降低时间分辨率。相反，单次胞体聚焦激发需要更高的瞬时能量，因此激活的神经元更少，但同时激发的视蛋白分子更多。螺旋扫描或者瞬时胞体聚焦激发均可实现高时间分辨（<1 ms），到目前为止，一些研究中报告的螺旋扫描和瞬时胞体聚焦激发的有效空间分辨率相当（横向5-10 μm和轴向20-40 μm）。

视蛋白分子的生物物理特性对于多光子全息实验设计的成功至关重要。一些微生物视蛋白的单通道电导相对较低，因此需要高水平的视蛋白表达来获得足够的光电流，以驱动在无毒多光子激发水平下的动作电位。由于这些原因，许多阳离子视蛋白，包括ChR2，对于多光子激发来说不是最优的。因此，近年来的一个关键问题是合理地设计或发现了新的微生物视蛋白，它们对光更敏感，并提供更大的最大光电流。视蛋白ChroME提供的光电流几乎是其父代视蛋白的四倍，在激活神经元方面比以前使用的视蛋白更有效。在此基础上，还出现了更强大的版本（ChroME2f和ChroME2s）。CoChR和ChRmine是天然存在的超强效视蛋白，对多光子激发也非常有利。这些视蛋白都允许在短时间内进行可靠的光学控制，同时能够以更少的总激光能量激活更多的神经元。 

尽管多光子光遗传学为精确调控神经活动提供了无与伦比的机会，但仍有一些关键挑战需要克服，以扩大其用途并提高控制精度。

首先是实现真正的“单细胞分辨率”，我们可以将“单细胞分辨率”定义为仅激活所需目标神经元的能力，而对附近其它神经元没有显著的直接影响。尽管多光子激发可以在大脑中实现高光学分辨率，但大量技术研究表明，多光子的空间有效分辨率在某些情况下大于典型神经元的大小，尤其是在轴向上。实现绝对单细胞精确控制的困难源于几个关键问题：需要激活神经元胞体上表达足够的视蛋白分子以使其达到动作电位阈值；树突中视蛋白分子的没有被完全限制；脑组织中神经元的堆积密度；细胞间视蛋白表达水平的异质性；神经元间甚至类似亚型的内在兴奋性的异质性。

目前有几种方法可以提高全息调控的空间保真度。首先，增加视蛋白的单通道电导，这样可以使用较低的功率将神经元驱动到阈值。第二，将视蛋白靶向到胞体表达，减少其他神经元因树突视蛋白而激活。第三，减少视蛋白的表达，使光学兴奋的神经元彼此距离更远。第四，为每个神经元提供恰当的光照，有助于最大限度地提高有效的空间保真度。

多光子光遗传学面临第二个挑战是如何增加可控系统规模，考虑到动物的某些行为可能需要大量神经元的共同激活，在同一个实验阶段使用双光子全息光遗传学对所有这些神经元进行光学控制是非常有利的。这里面主要有两个限制：视蛋白的效力和激光的功率。可以将多个高能激光器组合成一个显微镜，然而，根据全息目标的密度，过多的能量会导致大脑发热或组织损伤。

因此，增加可控神经集成规模的另一种方法是通过视蛋白优化。理想的视蛋白应具有较高的单通道电导，并且对重复光照几乎没有适应性。除了视蛋白优化外，当不需要同时精确激活一个神经元集合时，可以通过在一个SLM上交织多个全息图，针对不同的神经元子集，以及通过使用多个SLM和改变它们之间的关系，在潜在行为相关的时间段内共同激活更大的神经元群。

多光子光遗传学面临的另一个挑战是其控制的尺度，几乎所有的计算和行为都依赖于多个大脑区域之间的协调互动。即使在小鼠或者简单的感觉引导动作中，神经元活动也可能分布在相隔毫米的多个皮层区域。要理解一个大脑区域的活动模式如何导致下游区域的特定活动模式，需要同时对这些区域进行精确的光学控制和读取。

同样，理解从高到低的反馈的作用和影响同样需要一个具有大视场的类似灵活的显微镜。中尺度多光子显微镜，即在大于5mm的视野内实现同步成像的系统，为同时测量多个相关脑区的神经元活动打开了大门。将全息光遗传系统应用于这些中尺度显微镜将为理解信息如何在大脑区域之间传递并驱动行为提供了巨大的机会。尽管现有SLM的像素大小和数量不足以在这些超大体积上同时发光，但将SLM与快速振镜-振镜定位系统相结合，即使在约5×5 mm2的区域内，也可以实现近似的完全体积控制。

多光子光遗传还面临的挑战还包括对大脑深处的光遗传控制，在哺乳动物中，由于脑组织对光的散射，多数大脑结构远远超出从脑表面进行常规双光子成像或光学遗传学控制的范围。为了克服这一问题，许多研究要么移除了覆盖在上面的脑组织（例如皮质和白质），要么植入了中继透镜（例如GRIN透镜）或其他光学元件，这些方法也适用于双光子光遗传学。

另外的方法是使用三光子激发，它可以进入大脑达到近1.5mm的深度，这对于中等深度结构的成像效果很好，但是它需要更高的脉冲能量，有可能导致大脑发热或组织损伤。到目前为止，大脑表面的双光子光遗传学已被证明对小鼠初级视觉皮层的第5层有效，但更加深入、无创性的，可能需要三光子激发。

动物自由行为也是多光子光遗传所面临的挑战，在理解自然行为时，动物自由行为的能力几乎是强制性的。到目前为止，几乎所有现有的多光子全息光遗传学研究都需要在显微镜下固定头部。然而，通过使用基于柔性光纤的系统，可以对自由行为的动物进行远程单细胞分辨率的多光子成像和光遗传学研究。第一种方法是将显微镜与光纤耦合，通常从输出面连接到微物镜或GRIN透镜。所需的强度模式在显微镜物镜焦点处产生，通过纤维束传输，每个纤芯充当单独的“像素”，并重新聚焦到样品上。

这种方法已成功地用于在自由移动的动物中实现单光子同步模式激活和功能成像，并且与双光子成像兼容。一种更深入和更少侵入性的替代方案是直接用发丝大小的多模光纤代替光纤束插入动物大脑，不使用附加成像透镜。光纤通过叠加以不同速度传输的光学模式来传输图像，从而在输出时产生一幅杂乱的图像。

然而，由于光在多模光纤中的传播是确定的，因此可以使用数字全息原理来计算光纤输入处的光场，从而在光纤输出处产生所需的强度图案。但是，其兼容性尚待证明。最后，另一种替代方法是使用单模光纤将激发脉冲传送到植入动物头骨的全微型双光子显微镜，这种方法已经应用到自由移动的动物中并实现双光子功能成像。

多光子全息光遗传学精确地提供了在视野内同时激活任意神经元组合的能力，从而真正实现大量的可能刺激模式。然而由于时间和测试噪声等因素限制，在任何给定的实验条件下，我们只能够测试可能被扰动神经元的一小部分。最简单的方法是一次刺激一个神经元，并估计对整个网络的影响。这对于映射网络内的单一功能作用验证非常有用，但是，由于大多数单个神经元对整个网络的作用非常小，因此需要多次重复试验并且只能测试其中小部分神经元。更重要的是，大多数单个神经元不太可能产生足够的动力来影响下游的脑区或相关行为。因此，许多实验需要涉及到对神经元群的刺激，并且如何选择每个集合的成员、神经元的期望活动水平以及刺激模式的时间构成与最后光刺激的结果和解释有着深刻的内在联系。

在针对哺乳动物新皮层的研究中，目标神经元的激活似乎放大了功能耦合子网络的活动，这可能与共享、重复连接有关。这些研究推测，这种放大或类似的效应对于影响最终行为至关重要。因此，在高度重复的网络中（如新皮层），激活一小群神经元可能就足以改变行为。但是在其他稀疏的重复连接或主要为GABA能神经元的网络中（例如小脑或基底神经节），这种稀疏激活方案可能无法产生可测量的行为变化。神经网络能够进行多样化编码和高维刺激，通过对随机集合刺激并同步成像来首先构建预测网络模型，根据该模型来设计和测试光刺激方案，可以最大限度地推动网络沿着特定维度运行，潜在地揭示了新的刺激模式，驱动巨大、可预测的行为变化。

上述所有策略都依赖于预先设计的光刺激集合，或者是快速闭环全息光遗传学。闭环策略依据系统自身活动来选择特定全息刺激，类似于单个神经元的电压钳制，闭环全息光遗传学可以将特定集合的活动“钳制”到特定的活动水平。 

以往关于神经编码的绝大多数工作都依赖于神经活动的相关分析。多光子全息光遗传学可以为探索神经编码的逻辑和结构提供实验手段。

视觉感知中的同步性和峰时间，视觉皮层中的神经同步对感觉感知的贡献一直存在争论，大量证据支持瞬时编码和概率编码模式。这个问题可以利用多光子全息光遗传学解决。首先，我们可以在一组相关的视觉皮层神经元中驱动固定数量的动作电位，这些动作电位足以驱动视觉识别任务中适当的操作性反应。然后，我们可以在时域中重新组织完全相同数量的动作电位，使群体表现出不同程度的同步性，但每个神经元仍表现出完全相同的放电频率。如果改变时间结构对视觉辨别没有影响，我们可以合理的认为神经同步对感知并不重要；或者我们发现增加神经同步性有助于感知，那么可以比较不同频段的同步效果。

噪声和噪声相关性对感觉知觉的影响，皮层神经元放电频率对相同刺激表现出高度的试验-试验间的波动。对每个神经元来说，这种反应噪声并不是独立的，在很多情况下是相互关联的。尽管这些“噪声”相关性已被广泛用于推断神经环路中的集群结构，但这些相关性的功能影响仍不清楚，全息光学遗传学可以用来检验这些内部因果关系。

探讨神经活动的生理模式对功能的影响，由于神经元和突触的固有连接和生物物理学特性，神经元的群体活动局限于系统所有可能模式的一小部分中。多光子全息光遗传学可以驱动遵循神经网络低维结构的活动模式，并同时跟踪其对下游活动和行为的影响。

探索学习过程中突触可塑性对神经网络的影响和规律，突触的快速动态变化对学习和记忆的形成至关重要，峰时间依赖性可塑性（Spike Timing-Dependent Plasticity，STDP）可能是学习期间神经活动生理模式导致编码记忆的神经回路结构变化的主要部分。全息光遗传学与钙成像相结合、闭环全息光遗传学，可以用于测试学习和记忆形成过程突触可塑性变化。并且我们可以通过光遗传学方法将两个集合体的动作电位配对起来，完全全息地写入突触可塑性的模式，从而产生一个人工记忆。

类似地，我们可以使用全息光遗传学在学习之前、学习期间和学习之后对功能网络连接进行瞬时“快照”。功能网络可以通过一次刺激一个或几个神经元来映射，网络结构可以从网络中所有其它神经元的活动变化中推断出来。通过这种方法，我们可以识别环路中对学习至关重要的可塑性连接，甚至尝试通过全息诱导STDP的长时程抑制来逆转其可塑性，从而逆转学习。

尽管光遗传学在过去的15年里已经彻底改变了神经科学研究，但针对大脑功能研究的问题仍然超出了传统光遗传学方法能够解决的范围。双光子光遗传学能够提供必要的空间分辨率，在大脑的新皮质等区域，通过重建神经活动需要的精确模式来探索有关神经编码的一些重要问题。在多光子全息光遗传学中，仍然有一些关键的技术和挑战需要克服，包括如何扩大其光学控制规模和提高其空间保真度。多光子全息光遗传学也可能在未来成为治疗性光学-大脑界面的基础。

目前，脑假体主要依赖于电微刺激。与光遗传相比，电微刺激相对直接，并且不需要引入外源性的遗传元素，但它的空间分辨率相对较低，通常会激活经过的纤维并可能对组织造成伤害。在表层区域中，光学接口不需要穿透大脑，结合多光子激发，能够达到细胞分辨率。利用全息光遗传学的精确性，可以更有效地进行神经调控，从而为视觉或听觉障碍患者创建人工感知。也许从更广程度上推测，利用闭环全息光遗传学对高级皮层进行精确干预可以用来治疗认知障碍。