斑马鱼胚胎显微注射实验，更快速、可靠的基因探索方式

显微注射，利用显微操作系统在显微镜视野下控制显微注射针的移动，对细胞或胚胎进行精细注射的技术，是胚胎发育和基因功能研究的有力工具。斑马鱼作为模式生物，相比哺乳动物生长周期短、胚胎更容易获取，已被广泛应用于显微注射实验。通过显微注射技术将RNA、DNA、蛋白质等注射到发育中的胚胎中，为研究人员制备转基因或突变斑马鱼品系、探索基因功能提供了快速、可靠的方式。

实验仪器试剂

1、主要仪器包括：玻璃电极拉制仪、显微注射仪、显微操纵器、体视显微镜以及培养箱。

2、试剂耗材包括：斑马鱼胚胎培养液、酚红指示剂、玻璃毛细管、封口膜、塑料移液管、培养皿（4cm、10cm）、琼脂糖、注射槽模具、巴斯德吸管、矿物油等。

实验步骤

制备玻璃注射针：

1、拉针仪调节相应的温度、拉力以及拉制时间等参数拉制出合适针尖的玻璃注射针。

2、将拉好的注射针用细镊子将针尖折断，使针尖开口直径约为5-10 μm。用刀片切割或者磨针机以45度角倾斜打磨针头尖端开口，以产生更锋利的尖端利于穿刺胚胎。

制备胚胎注射槽：

注射槽示意图

1、往10cm培养皿内倒入20ml加热溶解的1.5%琼脂糖，待凝固。

2、将注射槽模具齿朝下放置，另外倒入20ml琼脂糖覆盖模具，小心避免引入任何气泡。

3、待凝固后取出注射槽模具形成注射槽，加入适量胚胎培养液盖上盖子封口膜封口4°C保存备用。        

注射体积校准：

1、将注射针安装到注射仪上，吸入待注射液。

2、在显微镜视野中心放一把微尺，上面放置一个装适量矿物油的4厘米的培养皿。

3、将注射针浸入矿物油中，注射一次得到一个液滴球，通过微尺测量球体直径计算出注射的体积，调整注射液滴的大小使其符合所需的直径。1 nL液滴的半径为0.062 mm (V = 4/3 π r3)。

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胚胎准备：

1、提前一天将雌雄斑马鱼按1:1比例放入专用斑马鱼交配缸内，中间用挡板隔开，注射当天早上抽除挡板让斑马鱼交配产卵。收集胚胎在显微镜下检查，选择1细胞期胚胎进行注射。

2、用培养液清洗经过挑选的胚胎，然后用移液管将胚胎转移到带注射槽的琼脂糖培养皿上，将胚胎按照相同的细胞极方向排列在注射槽的凹槽中。

3、吸除注射槽多余的培养基，建议刚好没过胚胎即可，防止注射时胚胎漂浮或粘附在注射针头上，也有助于注射针穿透胚胎外层绒毛膜。

胚胎注射：

注射示意图

1、将注射器针头安装在显微操纵器上，调整针头角度相对于注射板表面约为45度。

2、显微镜视野下通过显微操纵器调整注射针位置，使视野内胚胎和针尖均达到最佳清晰度。

3、控制显微操纵器将电极穿透绒毛膜和卵黄（Yolk），将适量液体注射到胚胎中，可在工作液添加的酚红显示注射效果。

4、缓慢平稳的从胚胎抽出电极，将针头移到下一个胚胎进行注射。

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胚胎培养：

1、将注射好的胚胎转移到干净的培养皿，加入新鲜培养液，培养箱28.5℃培养。

2、显微镜下观察胚胎发育，并挑除死亡胚胎，及时更换培养液。

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注意事项

1、斑马鱼胚胎首次卵裂时间在受精后10 ~ 30 min左右，1细胞阶段的显微注射必须在这段时间内进行。因此，需要提前做好注射准备工作，包括装好注射针，胚胎排列等等。

2、注射量过大会损伤胚胎，过小可能影响定量精确度和扩散的均匀程度，注射量应为胚胎体积的10%左右，一般为1nL，尽量控制在1.8nL以内。

3、制备精细、锋利的注射针是成功注射的关键，不要尝试使用切口不好或孔太大的注射针头，否则将无法达到最佳注射效果。

4、注射溶液的质量和浓度对于确保正确评估斑马鱼胚胎发育至关重要，浓度过高对胚胎有毒性作用，同时注射液中的杂质可能导致胚胎发育异常甚至死亡，影响后续实验结论。