斑马鱼胚胎显微注射实验,更快速、可靠的基因探索方式

斑马鱼胚胎显微注射实验,更快速、可靠的基因探索方式

作者:RWD
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显微注射,利用显微操作系统在显微镜视野下控制显微注射针的移动,对细胞或胚胎进行精细注射的技术,是胚胎发育和基因功能研究的有力工具。斑马鱼作为模式生物,相比哺乳动物生长周期短、胚胎更容易获取,已被广泛应用于显微注射实验。通过显微注射技术将RNA、DNA、蛋白质等注射到发育中的胚胎中,为研究人员制备转基因或突变斑马鱼品系、探索基因功能提供了快速、可靠的方式。


细胞注射


实验仪器试剂


1、主要仪器包括:玻璃电极拉制仪、显微注射仪、显微操纵器、体视显微镜以及培养箱。


2、试剂耗材包括:斑马鱼胚胎培养液、酚红指示剂、玻璃毛细管、封口膜、塑料移液管、培养皿(4cm、10cm)、琼脂糖、注射槽模具、巴斯德吸管、矿物油等。


实验步骤


制备玻璃注射针:


玻璃注射针


1、拉针仪调节相应的温度、拉力以及拉制时间等参数拉制出合适针尖的玻璃注射针。


2、将拉好的注射针用细镊子将针尖折断,使针尖开口直径约为5-10 μm。用刀片切割或者磨针机以45度角倾斜打磨针头尖端开口,以产生更锋利的尖端利于穿刺胚胎。


制备胚胎注射槽:


注射槽示意图

注射槽示意图


1、往10cm培养皿内倒入20ml加热溶解的1.5%琼脂糖,待凝固。


2、将注射槽模具齿朝下放置,另外倒入20ml琼脂糖覆盖模具,小心避免引入任何气泡。


3、待凝固后取出注射槽模具形成注射槽,加入适量胚胎培养液盖上盖子封口膜封口4°C保存备用。        


注射体积校准:


1、将注射针安装到注射仪上,吸入待注射液。


2、在显微镜视野中心放一把微尺,上面放置一个装适量矿物油的4厘米的培养皿。


3、将注射针浸入矿物油中,注射一次得到一个液滴球,通过微尺测量球体直径计算出注射的体积,调整注射液滴的大小使其符合所需的直径。1 nL液滴的半径为0.062 mm (V = 4/3 π r3)。


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胚胎准备:


1、提前一天将雌雄斑马鱼按1:1比例放入专用斑马鱼交配缸内,中间用挡板隔开,注射当天早上抽除挡板让斑马鱼交配产卵。收集胚胎在显微镜下检查,选择1细胞期胚胎进行注射。


2、用培养液清洗经过挑选的胚胎,然后用移液管将胚胎转移到带注射槽的琼脂糖培养皿上,将胚胎按照相同的细胞极方向排列在注射槽的凹槽中。


3、吸除注射槽多余的培养基,建议刚好没过胚胎即可,防止注射时胚胎漂浮或粘附在注射针头上,也有助于注射针穿透胚胎外层绒毛膜。


胚胎注射:


注射示意图

注射示意图


1、将注射器针头安装在显微操纵器上,调整针头角度相对于注射板表面约为45度。


2、显微镜视野下通过显微操纵器调整注射针位置,使视野内胚胎和针尖均达到最佳清晰度。


3、控制显微操纵器将电极穿透绒毛膜和卵黄(Yolk),将适量液体注射到胚胎中,可在工作液添加的酚红显示注射效果。


4、缓慢平稳的从胚胎抽出电极,将针头移到下一个胚胎进行注射。


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胚胎培养:


1、将注射好的胚胎转移到干净的培养皿,加入新鲜培养液,培养箱28.5℃培养。


2、显微镜下观察胚胎发育,并挑除死亡胚胎,及时更换培养液。


瑞沃德提供MP-500程控水平电极拉制仪、MM-500三轴电动显微操纵器、R480玻璃微电极注射泵组合方案,可对斑马鱼、爪蟾等模式生物胚胎、幼体进行超精细纳升显微注射。


瑞沃德胚胎注射系统

(瑞沃德胚胎注射系统)


注意事项


1、斑马鱼胚胎首次卵裂时间在受精后10 ~ 30 min左右,1细胞阶段的显微注射必须在这段时间内进行。因此,需要提前做好注射准备工作,包括装好注射针,胚胎排列等等。


2、注射量过大会损伤胚胎,过小可能影响定量精确度和扩散的均匀程度,注射量应为胚胎体积的10%左右,一般为1nL,尽量控制在1.8nL以内。


3、制备精细、锋利的注射针是成功注射的关键,不要尝试使用切口不好或孔太大的注射针头,否则将无法达到最佳注射效果。


4、注射溶液的质量和浓度对于确保正确评估斑马鱼胚胎发育至关重要,浓度过高对胚胎有毒性作用,同时注射液中的杂质可能导致胚胎发育异常甚至死亡,影响后续实验结论。


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