如何高效制备成年鼠肠道组织单细胞悬液?

如何高效制备成年鼠肠道组织单细胞悬液?

作者:RWD
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肠道是重要的消化器官,也是最大的屏障器官,与肠道菌群共生并且维持免疫稳态。其中在肠道的固有层中包含着众多的免疫细胞,其中包括了 T 细胞、B 细胞、 DC 细胞、巨噬细胞、粒细胞等,其共同构建了肠道黏膜免疫的屏障。因此在进行肠道黏膜免疫研究实验时,需要分离高质量原代固有层免疫细胞。

本次给大家介绍的是小鼠肠道固有层的解离实验,通过针对性肠组织试剂盒与配套标准优化程序,能够高效分离小鼠肠道固有层免疫细胞(调节性T细胞、树突状细胞等)。


如何高效制备成年鼠肠道组织单细胞悬液


实验仪器及材料
• 瑞沃德单细胞悬液制备仪;
• 瑞沃德加热套 HJ-400 ;
• 瑞沃德 DHIE-5007小鼠肠道组织温和酶解试剂盒;
• 瑞沃德 SCT-100组织处理管;
• 100μm 细胞滤器;
• 瑞沃德眼科手术器械;

• 细胞培养耗材、移液枪等。


实操步骤
1、试剂准备
按照说明书提示,分别配置清洗液和酶溶液,提取预热酶溶液。
2、样本准备

将取出的小鼠肠道组织预先剔除表面血管与脂肪组织,然后纵向剪开,用预冷PBS清洗干净肠道中的杂质。将肠道表面水分沥干,更换新的PBS浸泡,横向将肠道切成约0.5-1cm长的小段,再用PBS清洗一遍。之后用配置的清洗液,在37℃ 150rpm的恒温振荡水浴锅中,清洗样本30min。最后用PBS润洗两遍。


如何高效制备成年鼠肠道组织单细胞悬液


3、程序处理

转移到组织处理管中,并加入相应的提前预热酶溶液,运行程序M-Intestine-Heater-1。
4、单细胞悬液收集
程序运行结束后,用润湿后的100 μm细胞滤器过滤细胞悬液样本,50 mL离心管收集细胞悬液,300×g离心10min,彻底弃掉上清后,用适当缓冲液重悬后用于单细胞测序、流式细胞分析等。
5、去碎片化处理
转移细胞样本至15mL离心管,加入去碎片试剂后混匀,上层铺预冷的PBS,3000×g, 4℃,升速为5,降速为3,离心10min,保留下层细胞后洗涤收集。
6、裂红操作(可选)

7、细胞计数及流式检测


实操结果

使用瑞沃德单细胞悬液制备仪处理成年小鼠脑组织获得的细胞活性高可达88%,大于85%,细胞产量可达6.54*10^6/100mg,不影响下游实验。


如何高效制备成年鼠肠道组织单细胞悬液


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