巨噬细胞的抗/促炎活性探究筛选

巨噬细胞的抗/促炎活性筛选

巨噬细胞作为天然免疫系统中的细胞，其存活时间长，具备吞噬能力，与中性粒细胞同为感染的第一反应者。该细胞主要参与细胞碎片和病原体的识别、吞噬和降解，向T细胞呈递抗原以触发适应性免疫应答。而且，巨噬细胞也能诱导其它抗原呈递表达共刺激分子，从而启动适应性免疫反应。

在炎症早期阶段，巨噬细胞会释放多种细胞因子与趋化因子，以此吸引更多免疫细胞招募至炎症部位，发挥关键作用。

因此，深入研究巨噬细胞对药物的响应机制，有助于研发新型抗炎疗法，特别是针对炎症相关疾病，如自身免疫性疾病、过敏症及动脉粥样硬化等。

实验方法与参考结果

材料和试剂

•  细胞系：小鼠单核巨噬细胞系Raw264.7

•  试剂：DEME细胞培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)、脂多糖(LPS)、一氧化氮合酶抑制剂(L-NMMA)、细胞因子试剂盒、四噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(MTT)。

抗炎实验

•  细胞铺板

将生长状态良好的Raw264.7细胞，按照5x105个/mL细胞密度接于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养，待细胞生长至50%左右时，用100 μL不含FBS培养基代替旧培养基，饥饿处理12 h后，分为三组：(1) 空白对照组：仅含细胞和培养基；(2) LPS模型组：LPS终浓度为1 μg/mL；(3) 实验组：分别加入梯度浓度的待测样品和1 μg/mL的 LPS。每组均设3个复孔，每孔加入DEME完全培养基100 μL。在含5% CO2饱和湿度培养箱中保持37 ℃恒温培养24 h后，进行RAW264.7细胞形态观察，并通过MTT法测定细胞活力。

•  Griess法检测NO生成量

细胞处理操作如上所述，饥饿处理12h后，分为四组：

(1) 空白对照组：仅含细胞和培养基；

(2) LPS模型组：LPS终浓度为1 μg/mL；

(3)阳性药对照组：加入50 μM L-NMMA和1 μg/mL的LPS；

(4) 实验组：分别加入梯度浓度的待测样品和1 μg/mL的 LPS。

药物孵育24 h后，取50 μL上清液，加入另一96孔板中，加入等体积的室温Griess试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，轻轻混匀后，室温放置10 min， 酶标仪检测540 nm处吸光度，根据标准曲线计算细胞分泌的NO水平。

NO标准曲线的绘制

以1 mM的NaNO2溶液配制，以dd水稀释得到5、10、20、40、60、100 μM梯度浓度的标准溶液。取各浓度梯度下的NaNO2溶液50 μL于96孔板中，于室温下操作，分别加入相同体积的Griess试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，轻轻混匀后，放10 min，酶标仪检测540 nm处样品的吸光度，以NO摩尔浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

计算NO抑制率：NO抑制率=（LPS处理组-实验组）/LPS处理组×100%

•  ELISA试剂盒检测炎症因子生成量

细胞处理操作如上所述，将药物孵育24 h后的细胞，弃掉培养基，以预冷的PBS润洗3次，洗去残留的培养基，加入适量细胞裂解液，低温震荡裂解10 min。以移液器吹打裂解后的细胞，将裂解液移至离心管中，于4℃下12000 rpm离心5 min。离心后的上清分别采用细胞因子试剂盒进行检测，可选择细胞因子种类：COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6。

•  qRT-PCR检测iNOS、TNF-α表达量

细胞处理操作如上所述，将药物孵育24h后的细胞，弃掉培养基，以预冷的PBS润洗3次，洗去残留的培养基，加入Trizol裂解细胞，于无菌环境中提取细胞总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳检验RNA的降解情况。将获得的未降解RNA作为模板，反转录合成cDNA，以所得cDNA为模板，GAPDH为内参，加入对应引物，用SYBR Green Ⅰ荧光染料检测法进行扩增，检测细胞中iNOS、TNF-α的mRNA的水平。

•  Western Blot检测NF-κB蛋白及相关因子的表达量

细胞处理操作如上所述，将药物孵育24 h后的细胞，弃掉培养基，以预冷的PBS润洗3次，洗去残留的培养基，加入适量细胞裂解液(裂解液配方：50 μL=40 μL RIPA+5 μL磷酸酶抑制剂+0.5 μL PMSF，每100 mg组织加1 mL裂解液)，于冰上震荡裂解10min，将裂解液以12000 rpm离心30 min，收集裂解液。BCA测定蛋白含量，根据最低蛋白浓度样品(不要低于2 mg/mL，5 mg/mL会很好跑出条带)，以PBS和5X Loading Buffer进行调平。沸水浴10 min灭活，分装，-80 ℃保存。选择合适浓度的SDS-PAGE胶分离，每孔上样40 mg蛋白量（根据调平的蛋白浓度计算上样体积，注意，上样体积必须相同且对称，否则需以loading buffer补齐）。浓缩胶区域时设置电压60 V，以压平条带，进入分离胶区域后设置电压120 V，临结束前设置电压60 V，再次压平条带。湿转蛋白条带至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗涤三次后，二抗孵育2 h，PBST洗涤三次，ECL发光显色观察，检测各组蛋白表达量的变化。

促炎实验

促炎实验方法与抗炎模式相同，区别在于，设置细胞分组为：

(1) 空白对照组：仅含细胞和培养基；

(2) LPS模型组：LPS终浓度为1 μg/mL；

(3) 实验组：分别加入梯度浓度的待测样品，从而比较药物与LPS的促炎效果。

实验结果及讨论（以促炎实验为例i）

细胞形态观察

Raw264.7细胞形态主要为圆形。因其对环境非常敏感，在培养时会出现少量短梭形或多角形的分化细胞，而受到药物处理后，如果药物具有免疫刺激活性，其分化程度和比例进一步增多，整体表现为梭形，存在明显触角。如图a可见，不做任何处理的巨噬细胞为圆形，随着药物浓度升高，更多的细胞形态逐渐变成梭形，触角伸长，LPS处理组的细胞形态变化明显。

NO生成量

LPS作为强免疫原性颗粒，是炎症模型中广为应用的诱导剂。NO是一种重要的内源性信号分子，由巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞产生，具有防御病原体、调节免疫细胞功能、调节免疫代谢、诱导细胞凋亡等重要作用。如图b可见，LPS处理后NO分泌上调，药物组的NO分泌量表现出剂量依赖性，说明药物具有促炎活性。

TNF-α、IL-6表达量

TNF-α是主要的促炎细胞因子，由多种细胞类型分泌，包括巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、CD4+T细胞和NK细胞，IL-6是一种多效性细胞因子，参与免疫反应以及炎症、造血、骨代谢和胚胎发育，由淋巴细胞、巨噬细胞和单核细胞分泌产生。如图d, e可见，药物表现出与LPS同等效力的TNF-α诱导效果，药物对IL-6的诱导分泌具有剂量依赖性。

参考文献